DNA-孔隙-聚合酶复合物的酶促富集制造技术

本发明专利技术提供一种用于分离测序复合物的方法，所述方法包括在与聚合酶共价连接的纳米孔和与纯化部分缔合的寡核苷酸之间形成复合物，使用能够结合所述纯化部分的固体支撑物从所述复合物分离出任何未结合/未复合的纳米孔和寡核苷酸，以及使用酶组合物从所述固体支撑物裂解结合的复合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】DNA-孔隙-聚合酶复合物的酶促富集
公开了用于分离聚合酶复合物的方法，该聚合酶复合物随后并入生物芯片的膜中以进行多核苷酸的纳米孔测序。也公开了用于分离活性聚合酶复合物的核酸衔接子、包含该核酸衔接子的聚合酶复合物，以及使用该核酸衔接子分离活性聚合酶复合物的方法。
技术介绍
纳米孔是近年来兴起用于探究核酸序列和结构的无标记平台。数据典型地报告为与DNA序列相关联的离子电流变化的时间数列，因为该数据是通过跨受控于电压钳放大器的单个孔隙(pore)施加电场而测定的。可以在高带宽和高空间分辨率下检查数百至数千个分子。阻碍纳米孔成功作为可靠DNA分析工具的障碍是：获得足够数量的功能性测序复合物以允许使用生物芯片上的大多数孔(well)以及长聚合物诸如千碱基长度或更长(单链基因组DNA或RNA)或小分子(例如，核苷)的测序都需要进行扩增或标记。因此，对于有允许改善测序产率(例如，改善的生物芯片上功能性测序复合物数量)以及无需扩增或标记模板多核苷酸即可进行测序或鉴定的测序复合物存在需求。
技术实现思路
本公开提供一种用于分离测序复合物的方法，该方法包括在与聚合酶共价连接的纳米孔和与纯化部分缔合的寡核苷酸之间形成复合物，使用能够与该纯化部分结合的固体支撑物从该复合物中分离出任何未结合/未复合的纳米孔和寡核苷酸，以及使用酶组合物从该固体支撑物裂解所结合的复合物。在一些实施例中，该方法包括(a)将富集引物与样品DNA退火以形成经退火的模板寡核苷酸；(b)纯化经退火的模板寡核苷酸；(c)将缀合物与经退火的模板寡核苷酸组合以形成杂烩(Eintopf)；(d)将该杂烩与能够与纯化部分结合的固体支撑物组合以产生富集的杂烩；以及(e)以酶组合物裂解接头以释放纯化部分，从而释放测序复合物以提供富集的测序复合物溶液。在一些实施例中，该方法包括(a)将缀合物与含有纯化部分的经退火的模板寡核苷酸组合以形成杂烩，并且使缀合物与经退火的模板寡核苷酸结合以形成测序复合物；(b)将杂烩与能够与经退火的模板寡核苷酸的纯化部分结合的固体支撑物组合，(c)从结合的测序复合物分离出未结合的复合物组分；(d)以酶组合物裂解接头以释放纯化部分，其中纯化部分保持与固体支撑物缔合，从而释放测序复合物，以及(e)从测序复合物分离出固体支撑物以提供富集的测序复合物溶液。在所有实施例中，富集引物包含与衔接子的一部分互补的寡核苷酸、可酶促裂解的接头和纯化部分。在所有实施例中，该接头包含无碱基位点或至少一个尿嘧啶残基。在所有实施例中，该样品DNA是线性的、环状的或自引发的。在一些实施例中，该样品DNA已经与至少一个衔接子连接。在一些实施例中，该衔接子已经与该样品DNA的每一末端连接。在一些实施例中，该衔接子是哑铃状衔接子。在所有实施例中，该衔接子包含能够与富集引物结合的引物识别序列。在一些实施例中，纯化经退火的模板寡核苷酸包括与固体支撑物结合，该固体支撑物选择性地结合双链DNA。在一些实施例中，经退火的模板寡核苷酸在与缀合物复合之前未经纯化。在一些实施例中，该双链DNA的长度大于100个碱基对、长度大于500bp或长度大于1000bp。在一些实施例中，该双链DNA是多个DNA片段的串联体。在所有实施例中，该样品DNA包含条形码，该条形码包含样品标识和/或患者标识。在一些实施例中，该固体支撑物包含珠粒。在一些实施例中，该珠粒是顺磁珠。在一些实施例中，该珠粒包含羧基部分。在一些实施例中，该能够与纯化部分结合的固体支撑物是珠粒。在一些实施例中，该珠粒包含链霉亲和素。在一些实施例中，该珠粒是顺磁珠。在一些实施例中，溶液中测序复合物的浓度大于70％，大于75％，大于80％。在所有实施例中，该酶组合物包含核酸内切酶VIII、核酸内切酶III、裂解酶、糖酵解酶或其组合。在一个实施例中，提供一种用于制备生物芯片的方法，该方包括(a)分离测序复合物；(b)使该测序复合物在该生物芯片的脂质双层上流动；以及(c)向该芯片施加足以将测序复合物插入该脂质双层中的电压。在一些实施例中，该生物芯片具有的所述纳米孔测序复合物的密度为1mm2至少500,000个纳米孔测序复合物。在一些实施例中，至少70％的测序复合物是功能性纳米孔-聚合酶复合物。附图说明图1是本公开所述并且用于本公开方法中的各种组分的示意图。图2是本文该方法的示意图。图3示出了纳米孔检测方法中使用的pUC19哑铃状DNA模板的5466bp序列。图4示出了线性衔接子(上)和HEG衔接子(下)。按出现顺序，图中分别公开了SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO11和SEQIDNO12。具体实施方式对于本文和所附权利要求中的描述，单数形式“一个”和“一种”包括复数指代物，除非上下文另外明确指示。因此，例如，提到“一种蛋白质”包括超过一种蛋白质，并且提到“一种化合物”是指超过一种化合物。“包含”和“包括”可互换使用，并且不旨在限制。应进一步理解，如果对多个实施例的描述使用了术语“包含”，本领域技术人员应理解，在一些特定情况下，可使用语言“基本上由...组成”或“由...组成”替代性地描述实施例。若提供数值的范围，则除非上下文另外明确规定，否则应理解为，介于该范围上限与下限之间的该数值的每个中间整数和该数值的每个中间整数的每十分之一(除非上下文另外明确规定)以及所指定范围内的任何其他指定值或中间值，为本专利技术所涵盖。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该较小范围内，并且也为本专利技术所涵盖，以所指定范围内任何明确排除的限制为准。若所指定范围包括一个或两个限值，则排除那些所包括限制中的(i)任意一个或(ii)两个的范围也包括在本专利技术中。例如，“1至50”包括“2至25”、“5至20”、“25至50”、“1至10”等。应理解，前述通用性说明(包括附图)和下述详细说明两者均为示例性的且仅为解释性的，并且不是对本公开的限制。定义如本文所用，“核酸”是指一个或多个核酸亚基的分子，该核酸亚基包含核酸碱基即腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体中的一种。核酸可以指核苷酸(例如，dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)的聚合物，该核苷酸的聚合物也称为多核苷酸或寡核苷酸，并且核酸包括单链形式和双链形式的DNA、RNA及其杂合物。如本文所用，“核苷酸”是指核苷-5′-寡磷酸酯化合物，或核苷-5′-寡磷酸酯的结构类似物，其能够用作核酸聚合酶的底物或抑制剂。示例性的核苷酸包括但不限于，核苷-5′-三磷酸酯(例如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP)；具有长度为4个或更多个磷酸酯的5′-寡磷酸酯链(例如，5′-四磷酸酯、5′-五磷酸酯、5′-六磷酸酯、5′-七磷酸酯、5′-八磷酸酯)的核苷(例如，dA、dC、dG、dT和dU)；以及核苷-5′-三磷酸酯的结构类似物，其可具有修饰的核酸碱基部分(例如，取代的嘌呤或嘧啶核酸碱基)、修饰的糖部分(例如，O-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于分离测序复合物的方法，所述方法包括：/n(a)将富集引物与样品DNA退火以形成经退火的模板寡核苷酸；/n(b)纯化所述经退火的模板寡核苷酸；/n(c)将缀合物与所述经退火的模板寡核苷酸组合以形成杂烩；/n(d)将所述杂烩与能够与纯化部分结合的固体支撑物组合以产生富集的杂烩；以及/n(e)以酶组合物裂解接头以释放所述纯化部分，从而释放所述测序复合物以提供富集的测序复合物溶液。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180528 US 62/6771421.一种用于分离测序复合物的方法，所述方法包括：
(a)将富集引物与样品DNA退火以形成经退火的模板寡核苷酸；
(b)纯化所述经退火的模板寡核苷酸；
(c)将缀合物与所述经退火的模板寡核苷酸组合以形成杂烩；
(d)将所述杂烩与能够与纯化部分结合的固体支撑物组合以产生富集的杂烩；以及
(e)以酶组合物裂解接头以释放所述纯化部分，从而释放所述测序复合物以提供富集的测序复合物溶液。


2.一种用于分离测序复合物的方法，所述方法包括：
(a)将缀合物与包含纯化部分的经退火的模板寡核苷酸组合以形成杂烩，并且使所述缀合物结合所述经退火的模板寡核苷酸以形成测序复合物；
(b)将所述杂烩与能够与所述经退火的模板寡核苷酸的所述纯化部分结合的固体支撑物组合，
(c)将未结合的复合物组分与结合的所述测序复合物分离；
(d)以酶组合物裂解接头以释放所述纯化部分，其中所述纯化部分保持与所述固体支撑物缔合，从而释放所述测序复合物，以及
(e)将所述固体支撑物与所述测序复合物分离，以提供富集的测序复合物溶液。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述富集引物包含与衔接子的一部分互补的寡核苷酸、可酶促裂解的接头和纯化部分。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述接头包含无碱基位点或至少一个尿嘧啶残基。


5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·富兰克林，K·迪曼，A·王，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH