CAR NK细胞制造技术

本发明专利技术涉及制造用慢病毒载体遗传修饰的自然杀伤(NK)细胞的领域，这些慢病毒载体携带编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。本发明专利技术进一步涉及用方法获得的CAR‑NK细胞，和这些CAR‑NK细胞在医学中、特别是用于在治疗癌症的方法中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】CARNK细胞
本专利技术涉及制造用慢病毒载体遗传修饰的自然杀伤(NK)细胞的领域，这些慢病毒载体携带编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。本专利技术进一步涉及CAR-NK细胞，和这些CAR-NK细胞在医学中、特别是用于治疗癌症中的用途。
技术介绍
本专利技术集中于开发自然杀伤细胞的制造方法，这些自然杀伤细胞是用携带至少一种编码CAR的多核苷酸的慢病毒载体遗传修饰的自然杀伤细胞(CAR-NK细胞)。本专利技术的制造方法允许获得以NK细胞和CAR的治疗效果之间的有效协同作用为特征的细胞群体。自然杀伤细胞(NK细胞)是具有高抗肿瘤、抗病毒和抗微生物活性的先天性免疫系统的细胞。在报道了NK细胞在患有癌症的患者中的成功过继性转移和体内扩增后，将NK细胞用于治疗癌症引起了关注[Ruggeri等人(2005)CurrOpinImmunol[免疫学当前观点]17:211-7；Ren等人(2007)CancerBiotherRadiopharm[癌症生物治疗和放射药物]22:223-34；Koehl等人(2004)BloodCellsMolDis[血细胞分子和疾病]33:261-6.176；Passweg等人(2004)Leukaemia[白血病]18:1835-8]。通常，在这些研究中，供体NK细胞输注的耐受性良好且没有诱导GvHD的证据。然而，迄今为止，在患有癌症的患者中，只进行了少数研究过继性NK细胞输注的试验。主要障碍是仅相对少量NK细胞可以从常规白细胞去除术产物分离。这妨碍了患有癌症的人中NK细胞剂量依赖性抗肿瘤应答的临床试验[Klingemann等人(2004)Cytotherapy[细胞疗法]6:15-22；Passweg等人(2006)BestPractResClinHaematol[临床血液学最佳实践和研究]19:811-824；McKenna等人(2007)Transfusion[输液]47:520-528；Koehl等人(2005)KlinPadiatr[小儿科杂志]217:345-350；Iyengar等人(2003)Cytotherapy[细胞疗法]5:479-484；Meyer-Monard等人(2009)Transfusion[输液]49:362-371]。因此，正在研究的用于扩增和激活NK细胞的离体方案，使得能够实现更高NK细胞剂量的临床试验，并且允许多次NK细胞输注[Carlens等人(2001)HumImmunol[人类免疫学]62:1092-1098；Barkholt等人(2009)Immunotherapy[免疫疗法]1:753-764；Berg等人(2009)Cytotherapy[细胞疗法]11:341-355；Fujisaki等人(2009)CancerRes[癌症研究]69:4010-4017；Siegler等人(2010)Cytotherapy[细胞疗法]12(6):750-63]。然而，大多数方案通过使用支持性饲养细胞系来处理技术缺点，这些支持性饲养细胞系对于大规模和多中心试验而言会导致产生NK细胞产物的调控问题。先前，我们已经描述了具有以高细胞数目、高纯度和功能性从CD34+造血干细胞产生临床相关的NK细胞产物的能力的替代性基于细胞因子的培养方法[Spanholtz等人(2010)PLoSOne[公共科学图书馆综合]5:e9221]。我们已经进一步优化了CD34+的富集，并且开发了导致高产率激活的CD34+细胞来源的NK细胞的可扩展程序。嵌合抗原受体(CAR)是识别在靶细胞上表达的特定蛋白质或抗原的重组受体。一旦CAR在T淋巴细胞中表达(则被称为CAR-T细胞)或免疫系统的其他细胞中表达，就能够针对表达其结合的抗原的所有细胞重定向特异性免疫应答。CAR研究最广泛的临床应用是癌症免疫疗法，该癌症免疫疗法包括输注携带靶向肿瘤抗原的CAR的免疫系统的细胞，例如T细胞或NK细胞。此类细胞能够针对表达由CAR靶向的抗原的细胞产生强抗肿瘤应答(Sadelain等人,CancerDiscovery[癌症发现].2013.3(4):388-98)。CAR是由负责抗原识别的胞外结构域(通常源自单链可变片段(scFv))、间隔区、跨膜结构域、以及传递激活和共刺激信号至表达它们的细胞的胞内结构域组成的重组嵌合蛋白。取决于信号传导结构域的数量，将CAR分为第1代(一个)、第2代(两个)、或第3代(三个)CAR(Dotti等人,ImmunolRev.[免疫学综述]2014年1月；257(1))。“间隔区”或“绞链区”是胞外结构域和跨膜结构域之间的连接序列。用作间隔子的最常见序列是恒定免疫球蛋白IgG1铰链-CH2-CH3Fc结构域。WO2016/042461披露了包含源自人低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)的胞外结构域的间隔区的CAR。现在有若干种CAR-T细胞候选物正在临床开发中，并且出现了不同的成功案例。美国食品药品监督管理局(FDA)最近批准了替萨根微核(tisagenlecleucel)(第一种CART细胞疗法，适用于治疗上至25岁、患有难治性或处于二次复发或后期复发的B细胞前体急性成淋巴细胞性白血病(ALL)的患者)和axicabtageneciloleucel(适用于治疗在两个或更多个全身疗法线后仍患有复发性或难治性大B细胞淋巴瘤的成年患者)。大多数CAR-T细胞研究已经使用自体T细胞，因为同种异体T细胞具有发展移植物抗宿主病(GvHD)(这是一种严重且潜在致死的不良事件，包括同种异体T细胞针对宿主组织的攻击)的显著风险。自体CAR修饰的T细胞的制造是患者特异性的并且具有一些实践限制。经遗传修饰以表达CAR的NK细胞(CAR-NK细胞)的开发仍然处于早期开发阶段。使用靶向不同抗肿瘤剂的CAR-NK细胞进行的临床前研究和临床研究综述于：Martin-Antonio等人,IntJMolSci.[国际分子科学杂志]2017年8月29日；18(9)。预期CAR-NK细胞与CAR-T细胞相比具有若干优点。在制造方面，由于NK细胞不引起GvHD，它们提供了产生可用于直接临床用途的成品同种异体产物的机会。此外，自体的和同种异体的NK细胞具有受限的体内持久性，这使得不太可能发生危及生命的毒性(像细胞因子释放综合征)。从功效角度，一旦将NK细胞用CAR工程化，应保留它们的天然受体，从而允许通过除由CAR特异性介导的机制以外的机制来介导抗肿瘤作用(Rezvani等人,Mol.Ther.[分子疗法]2017年8月；25(8))。用于NK细胞工程化的不同策略目前还在开发中。迄今为止，公布的关于CAR-NK细胞的大多数临床前和早期临床研究已经利用了NK细胞系来表达CAR分子(Martin-Antonio等人,IntJMolSci.[国际分子科学杂志]2017年8月29日；18(9))，其中对NK-92细胞系的研究最广泛。尽管NK-92细胞在制造方面存在一些潜在优点，但是NK-92细胞具有如下显著的临床缺点需要纳入考虑：潜在的致肿瘤性，这是因为它们源自受非霍奇金淋巴瘤、多种细胞遗传学异常、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制造用嵌合抗原受体(CAR)遗传修饰的NK细胞的群体的方法，该方法包括：/n(i)第一阶段：根据以下步骤产生含有CD34+细胞的中间体细胞群体，这些细胞携带编码CAR的至少一种多核苷酸：/na)获得选自由以下组成的组的生物起始样品：骨髓、外周血、胎盘或脐带血，/nb)从此类生物样品分离造血干细胞，/nc)在培养基I的存在下，培养分离的造血干细胞，/nd)通过将培养的干细胞与携带编码CAR的至少一种多核苷酸的慢病毒载体一起孵育来转导此类细胞，从而获得含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体，以及/ne)任选地，在培养基I中培养该含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体至少一天，其中/n培养基I是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含白介素-7，和干细胞因子(SCF)、flt-3配体(FLT-3L)、血小板生成素(TPO)中的一种或多种，以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和白介素-6(IL-6)中的两种或更多种，/n(ii)第二阶段，该第二阶段包括：/n任选的预备步骤：在培养基II中进一步扩增来自该第一阶段的该含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体，由此获得含有CAR-CD34+干细胞和CAR-NK祖细胞的细胞群体，其中培养基II是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、FLT-3L白介素-15(IL-15)和IL-7中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF和IL6中的两种或更多种，以及/n将来自阶段I的该含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体、或来自该任选的预备步骤的该含有CAR-CD34+干细胞和CAR-NK祖细胞的细胞群体扩增和分化成含有CAR-NK细胞的细胞群体的步骤，该步骤包括在培养基III中培养来自阶段I的含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体、或来自该任选的预备步骤的含有CAR-CD34+干细胞和CAR-NK祖细胞的细胞群体，由此获得含有NK细胞的细胞群体，其中该培养基III是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、IL-7、IL-15和白介素-2(IL-2)中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF、和IL-6中的两种或更多种，/n其中该嵌合抗原受体针对CD44v6。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180530 EP 18175055.51.一种用于制造用嵌合抗原受体(CAR)遗传修饰的NK细胞的群体的方法，该方法包括：
(i)第一阶段：根据以下步骤产生含有CD34+细胞的中间体细胞群体，这些细胞携带编码CAR的至少一种多核苷酸：
a)获得选自由以下组成的组的生物起始样品：骨髓、外周血、胎盘或脐带血，
b)从此类生物样品分离造血干细胞，
c)在培养基I的存在下，培养分离的造血干细胞，
d)通过将培养的干细胞与携带编码CAR的至少一种多核苷酸的慢病毒载体一起孵育来转导此类细胞，从而获得含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体，以及
e)任选地，在培养基I中培养该含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体至少一天，其中
培养基I是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含白介素-7，和干细胞因子(SCF)、flt-3配体(FLT-3L)、血小板生成素(TPO)中的一种或多种，以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和白介素-6(IL-6)中的两种或更多种，
(ii)第二阶段，该第二阶段包括：
任选的预备步骤：在培养基II中进一步扩增来自该第一阶段的该含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体，由此获得含有CAR-CD34+干细胞和CAR-NK祖细胞的细胞群体，其中培养基II是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、FLT-3L白介素-15(IL-15)和IL-7中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF和IL6中的两种或更多种，以及
将来自阶段I的该含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体、或来自该任选的预备步骤的该含有CAR-CD34+干细胞和CAR-NK祖细胞的细胞群体扩增和分化成含有CAR-NK细胞的细胞群体的步骤，该步骤包括在培养基III中培养来自阶段I的含有CAR-CD34+干细胞的中间体细胞群体、或来自该任选的预备步骤的含有CAR-CD34+干细胞和CAR-NK祖细胞的细胞群体，由此获得含有NK细胞的细胞群体，其中该培养基III是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、IL-7、IL-15和白介素-2(IL-2)中的两种或更多种，以及...

【专利技术属性】
技术研发人员：扬·斯潘霍尔茨，尼娜·科克，亚历山德拉·加蒂，朱利亚娜·瓦兰蒂，卡蒂亚·特拉韦尔萨里，
申请(专利权)人：格雷克斯迪姆医疗私人有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL