新抗微生物融合蛋白制造技术

本发明专利技术涉及一种多肽，其包含革兰氏阴性内溶素和选自以下的肽：抗微生物肽、两亲性肽、阳离子肽、寿司肽或防御素，其中所述内溶素又包含根据SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的序列。本发明专利技术还涉及相应的核酸、载体、噬菌体、宿主细胞、组合物和试剂盒。本发明专利技术还涉及所述多肽、核酸、载体、噬菌体、宿主细胞、组合物和试剂盒在通过手术或疗法治疗人体或动物体的方法中或在人体或动物体上实践的诊断方法中的用途。还可以将根据本发明专利技术的多肽、核酸、载体、噬菌体、宿主细胞、组合物和试剂盒用作例如食品或饲料中，化妆品中的抗微生物剂，或用作消毒剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新抗微生物融合蛋白本专利技术涉及一种多肽，其包含革兰氏阴性内溶素和选自以下的肽：抗微生物肽、两亲性肽、阳离子肽、寿司肽或防御素，其中所述内溶素又包含根据SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的序列。本专利技术还涉及相应的核酸、载体、噬菌体、宿主细胞、组合物和试剂盒。本专利技术还涉及所述多肽、核酸、载体、噬菌体、宿主细胞、组合物和试剂盒在通过手术或疗法治疗人体或动物体的方法中或在人体或动物体上实践的诊断方法中的用途。还可以将根据本专利技术的多肽、核酸、载体、噬菌体、宿主细胞、组合物和试剂盒用作例如食品或饲料中，化妆品中的抗微生物剂，或用作消毒剂。对常规抗生素的抗药性正在成为人类日益增加的健康风险。新的抗生素抗药性机制正在出现并在全球迅速传播。因此，在不久的将来，治疗常见传染病的能力可能会越来越困难。在本领域中已经很容易理解这种危险，并且探索了对抗细菌感染因子的新方法。其中，这些新方法是将内溶素与不同种类的肽组合形成融合蛋白。内溶素是由噬菌体(即，细菌病毒)编码的胞壁质水解酶(特别是肽聚糖水解酶)。其在噬菌体增殖的裂解周期的晚期基因表达过程中合成，并通过细菌肽聚糖的降解来介导后代病毒体从感染细胞的释放。就酶活性而言，其通常是β(1,4)-糖基化酶(溶解酶)、转糖基化酶、酰胺酶或内肽酶。在1991年已提出了内溶素的抗菌应用。尽管对内溶素的杀伤能力已经知晓了很长时间，但是由于抗生素的成功和优势，忽视了将这些酶作为抗菌剂的用途。仅在出现了多种抗生素耐药细菌之后，这种用内溶素对抗人类病原体的简单概念才引起人们的兴趣。迫切需要开发出新型抗菌剂，而作为“酶抗生素(enzybiotics)”(即“酶”和“抗生素”混合术语)的内溶素完全可以满足这一需求。在2001年，Fischetti及其同事首次证明了噬菌体C1内溶素对A组链球菌的治疗潜力。从那时起，很多出版物已将内溶素确立为控制细菌感染(尤其是革兰氏阳性细菌感染)的有吸引力和互补的替代方法。随后，已证明针对其他革兰氏阳性病原体(如肺炎链球菌、炭疽芽孢杆菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌)的不同内溶素具有作为酶抗生素的功效。而长期以来，内溶素治疗的最重要挑战在于革兰氏阴性细菌对内溶素的外源性作用不敏感，因为外膜屏蔽了内溶素与肽聚糖的接触。革兰氏阴性细菌具有外膜，以其特征性的不对称双层作为标志。外膜双层由包含磷脂(主要是磷脂酰乙醇胺)的内部单层和主要由单个糖脂脂多糖(LPS)组成的外部单层组成。细菌界中存在大量的LPS结构，并且LPS结构可能会因应当前的环境条件而被修改。LPS层的稳定性以及不同LPS分子之间的相互作用主要是通过二价离子(Mg2+、Ca2+)与LPS分子的阴离子组分(脂质A中的磷酸酯基团以及KDO的内核和羧基)的静电相互作用来实现的。此外，脂质A的疏水部分的致密和有序堆积，由于缺乏不饱和脂肪酸的青睐，因而形成具有高粘度的刚性结构。这使其对亲脂分子的渗透性降低，并赋予外膜(OM)额外的稳定性。为了克服外膜的屏蔽效应，已成功地将革兰氏阴性细菌的内溶素与例如阳离子、两亲性、疏水性或抗微生物肽融合。与未加入的情况相比，当加入时，此类融合蛋白能够消除革兰氏阴性细菌(参见例如WO2010/023207、WO2010/149792、WO2011/134998、WO2012/146738或WO2015/121443)。然而，为了获得改善的抗菌活性，通常将所述融合蛋白与少量乙二胺四乙酸(EDTA)组合。EDTA是一种螯合剂，是已知的外膜透化剂(Vaara,M.Microbiol.Rev.1992Sep；56(3):395-411，通过引用并入本文)。通过从其结合位点除去二价阳离子，引起外膜破坏，这通常改善了上述融合蛋白的抗菌活性(参见例如WO2010/023207，表6和表8)。尽管在各种应用领域中，EDTA的使用是完全可以接受的(例如，在消毒剂中)，但是在其他应用领域中，EDTA或其他外膜通透剂的并行使用是次优甚至是不理想的(例如，在动物饲料、食品安全、医疗设备领域，以及通常在制药领域)，因为EDTA会与任何种类的阳离子(不仅是细菌膜上的阳离子)非特异性地形成复合物。因此，本领域仍然需要进一步改进此类抗菌融合蛋白的设计，特别是对于不允许并行使用EDTA的应用。因而，本专利技术要解决的问题是提供上述类型的新的抗菌剂，其表现出(特别是在生理条件下)抗菌活性，并且较少依赖于平行存在的EDTA或其他外膜透化物质。该问题通过所附权利要求书中定义的和下面阐述的主题来解决。本专利技术的专利技术人已令人吃惊的发现，当与阳离子、两亲性或抗微生物肽融合时，显示出某些序列基序(分别是SEQIDNO:1或SEQIDNO:2)的内溶素是特别有用的。与未加入的情况相比，当加入革兰氏阴性细菌(如大肠杆菌)中时，所得到的融合蛋白显示出显著的抗菌活性，而且令人吃惊的是，与此同时，与这种类型的其他抗菌融合蛋白相比，其对于EDTA作为革兰氏阴性菌外膜透化剂平行存在的依赖性要小得多。这种令人吃惊的性质使这些多肽特别适于在EDTA敏感的应用领域中使用。如本文所用，术语“多肽”特别是指通过肽键以特定序列连接的氨基酸聚合物。多肽的氨基酸残基可以通过例如碳水化合物和磷酸酯等各种基团的共价附着来修饰。其他物质可以与多肽更松散地结合，例如血红素或脂质，产生缀合的多肽，其也包括在如本文所用的术语“多肽”中。如本文使用，该术语还旨在包括蛋白质。因此，术语“多肽”还包括例如两个或更多个氨基酸聚合物链的复合物。术语“多肽”确实包括多肽的实施方案，所述多肽任选表现出本领域通常使用的修饰，例如，生物素化、乙酰化、聚乙二醇化、氨基、SH-或羧基(例如，保护基团)的化学变化等。从下面的描述中可以明显看出，根据本专利技术的多肽是人工工程改造的多肽，其在自然界中不以这种形式存在。此类多肽可以例如相对于天然存在的多肽表现出人工突变，或者可以包含异源序列，或者可以是天然存在的多肽片段，该片段在自然界中不会以这种形式出现。此外，根据本专利技术的多肽是融合蛋白，即代表至少两个氨基酸序列的连接，所述氨基酸序列在该组合中自然不存在。如本文所用，术语“多肽”不限于氨基酸聚合物链的特定长度。通常但不是必须的，本专利技术的典型多肽的长度将不超过约1000个氨基酸。本专利技术的多肽可以例如为至多约750个氨基酸的长度、至多约500个氨基酸的长度或者至多约300个氨基酸的长度。因此，本专利技术多肽的可能的长度范围但不限于此，例如可以是16至1000个氨基酸，16至约50个氨基酸，约200至约750个氨基酸，或约225至约600个氨基酸，或约250至约350个氨基酸。如本文所用，术语“胞壁质水解酶”是本领域中的通常理解。其指能够水解细菌(如革兰氏阴性细菌)的肽聚糖的任何多肽。该术语不限于特定的酶促切割机制。就切割机制而言，胞壁质水解酶可以是例如内肽酶、几丁质酶、T4样胞壁质酶(muraminidase)、λ样胞壁质酶、N-乙酰基-胞壁酰-L-丙氨酸-酰胺酶(酰胺酶)、胞壁酰基-L-丙氨酸-酰胺酶、胞壁质酶、裂解性转糖基酶(C)、裂解性转糖基酶(M)、N-乙酰基-胞壁质酶(溶菌酶)、N-乙酰基-氨基葡糖苷酶或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽，其包含革兰氏阴性内溶素和选自以下的肽：抗微生物肽、两亲性肽、阳离子肽、寿司肽或防御素，/n其中所述内溶素又是包含根据SEQ ID NO:2的序列的内溶素，/n条件是：/na)所述多肽既不包含根据SEQ ID NO:3的序列，也不包含根据SEQ ID NO:4的序列，也不包含根据SEQ ID NO:5的序列，/nb)所述内溶素不是肠杆菌噬菌体JS98的EpJS98_gp116，/nc)如果所述多肽包含SEQ ID NO:6所示的序列，则肽选自以下：抗微生物肽、两亲性肽、寿司肽或防御素，/nd)如果所述内溶素具有选自以下的序列：/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180530 EP 18175064.71.一种多肽，其包含革兰氏阴性内溶素和选自以下的肽：抗微生物肽、两亲性肽、阳离子肽、寿司肽或防御素，
其中所述内溶素又是包含根据SEQIDNO:2的序列的内溶素，
条件是：
a)所述多肽既不包含根据SEQIDNO:3的序列，也不包含根据SEQIDNO:4的序列，也不包含根据SEQIDNO:5的序列，
b)所述内溶素不是肠杆菌噬菌体JS98的EpJS98_gp116，
c)如果所述多肽包含SEQIDNO:6所示的序列，则肽选自以下：抗微生物肽、两亲性肽、寿司肽或防御素，
d)如果所述内溶素具有选自以下的序列：









宿主
噬菌体名称
蛋白ID


气单胞菌术
气单胞菌噬菌体65
YP_004300997.1


埃希氏菌属
埃希氏菌噬菌体wV7
AEM00790.1


埃希氏菌属
肠杆菌噬菌体vB_EcoM-VR7
YP_004063811.1


埃希氏菌属
肠杆菌噬菌体Bp7
AEN93735.1


埃希氏菌属
肠杆菌噬菌体AR1
BAI83135.1


埃希氏菌属
肠杆菌噬菌体JS10
YP_002922463.1


埃希氏菌属
肠杆菌噬菌体IME08
YP_003734260.1


埃希氏菌属
肠杆菌噬菌体CC31
YP_004009990.1


埃希氏菌属
肠杆菌噬菌体RB69
NP_861818.1


埃希氏菌属
肠杆菌噬菌体RB14
YP_002854463.1


埃希氏菌属
肠杆菌噬菌体RB32
ABI94948.1


埃希氏菌属
肠杆菌噬菌体RB51
YP_002854084.1


志贺氏菌属
志贺氏菌噬菌体Shfl2
YP_004415022.1






和另外仅缺少N-末端甲硫氨酸的相应序列，则所述多肽不包含i)模块化革兰氏阴性内溶素或ii)噬菌体尾/基板蛋白的细胞壁结合结构域，
e)如果所述内溶素具有根据以下的氨基酸2-164的序列，则所述多肽不包含i)模块革兰氏阴性内溶素或ii)噬菌体尾/基板蛋白的细胞壁结合结构域：









宿主
噬菌体名称
蛋白ID


埃希氏菌属
肠杆菌噬菌体T4
YP_049736.1






f)如果所述内溶素具有根据以下的氨基酸2-161的序列，则所述多肽不包含i)模块革兰氏阴性内溶素或ii)噬菌体尾/基板蛋白的细胞壁结合结构域：









宿主
噬菌体名称
蛋白ID


埃希氏菌属
肠杆菌噬菌体JS98
YP_...

【专利技术属性】
技术研发人员：M比布尔，M格里斯尔，
申请(专利权)人：莱桑多公司，
类型：发明
国别省市：列支敦士登;LI