氨基脲在贝类组织中存在形态和含量的测定方法技术

本发明专利技术涉及一种氨基脲在贝类组织中存在形态和含量的测定方法，属于水产品检测技术领域，本发明专利技术方法证实了贝类组织中氨基脲同时以结合态和游离态的形式存在，并提供了两种形态氨基脲含量的检测方法。本发明专利技术方法在贝类外套膜、性腺、闭壳肌和内脏组织中氨基脲的检测限均为0.5μg/kg。氨基脲在1.0μg/kg～10μg/kg添加浓度范围内，回收率为70％～120％，本方法的批内相对标准偏差和批间相对标准偏差均≤15％。本发明专利技术首次建立了环境污染物氨基脲在贝类中存在形态和含量的测定方法，测定结果更加准确可靠，灵敏度高，结果重现性好，定量准确，并首次明确了环境污染物氨基脲在贝类体内的存在形态。

【技术实现步骤摘要】
氨基脲在贝类组织中存在形态和含量的测定方法
本专利技术属于水产品检测
，是一种用高效液相色谱-串联质谱法(LC/-MS/MS)检测贝类组织中环境污染物氨基脲存在形态和含量的测定方法。
技术介绍
氨基脲(Semicarbazide,SEM)一直被认为是呋喃西林药物的特征性代谢产物,常作为监测食品中非法使用呋喃西林药物的标志物。欧盟、日本及中国先后规定呋喃西林及其代谢物在动物源性食品中不得检出。但近年来研究表明，呋喃西林的代谢降解并非是水产品中氨基脲残留的唯一来源，很多途径均可以引入氨基脲污染。氨基脲的主要来源包括：(1)呋喃西林药物的分解呋喃西林是人工合成的广谱抗菌药物，对大多数革兰氏阳性细菌和阴性菌、某些真菌以及原虫具有抗菌杀虫作用，在水产养殖业中曾被广泛使用。呋喃西林在动物体内可被迅速分解代谢，最终形成稳定性高、残留时间长、毒性作用更强的代谢产物-氨基脲，这是环境中氨基脲的主要来源之一。(2)化工原料和医药合成中间体氨基脲常用作测定和合成醛酮、氰酸盐的试剂。氨基脲被用于许多制药过程，特别是用于金属氨基脲衍生物的有机合成。(3)偶氮二甲酰胺的分解偶氮二甲酰胺常被作为与食品接触的塑料发泡剂使用，其在高温下分解可产生氨基脲，如在玻璃包装食品(包括婴幼儿食品、水果汁、果酱、蜂蜜等)金属盖垫圈中的氨基脲就来源于偶氮二甲酰胺的热分解。此外，偶氮二甲酰胺作为面粉发泡剂，在高温条件下可分解产生氨基脲。(4)食品经次氯酸盐处理可产生氨基脲在经次氯酸盐溶液处理的北海虾、鸡肉、牛奶、蛋白粉、大豆片、红藻和卡拉胶等样品中均检出氨基脲，表明氨基脲是次氯酸盐与食品中氨基酸作用后的产物。(5)氨基脲天然存在于一些动物和植物体内。上述各种途径产生的氨基脲均可能排入环境，成为环境中的一种新型污染物，污染水生生物赖以生存的环境，最终在其体内蓄积。目前已有文献报道部分海域的海水、海底沉积物已经受到不同程度的污染，同时在海洋生物体内检测到氨基脲残留。然而环境中的氨基脲进入贝类体内之后究竟是以结合态形式存在还是以游离态形式存在，目前尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是建立一种环境污染物氨基脲在贝类组织中存在形态和含量的检测方法。本专利技术方法证实了贝类组织中氨基脲同时以结合态和游离态的形式存在，并提供了两种形态氨基脲含量的检测方法：分别测定氨基脲总量和结合态氨基脲，再计算游离态氨基脲含量。氨基脲总量测定方法：用盐酸水解样品，2-硝基苯甲醛衍生化，定量加入磷酸氢二钾溶液，加入乙酸乙酯液液萃取，上清液经浓缩、净化后，经液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量。结合态氨基脲的测定方法为样品分别用甲醇/水、甲醇和水分别洗涤游离态氨基脲，再加入盐酸水解，按照上述步骤测定结合态氨基脲含量。氨基脲总量减去结合态氨基脲即为游离态氨基脲含量。本专利技术方法在贝类外套膜、性腺、闭壳肌和内脏组织中氨基脲的检测限均为0.5μg/kg。氨基脲在1.0μg/kg～10μg/kg添加浓度范围内，回收率为70％～120％，本方法的批内相对标准偏差和批间相对标准偏差均≤15％。本专利技术是按照以下操作方法完成的：一种氨基脲在贝类组织中存在形态和含量的测定方法，它包括氨基脲总量的测定、结合态氨基脲的测定、标准曲线的绘制、所用的仪器条件和定性与定量，具体步骤如下：1)氨基脲总量的测定(1)样品水解和衍生化样品中加入盐酸、衍生化试剂、同位素内标，37℃水解和衍生化16h，取出放置至室温；进一步，所述步骤(1)中的衍生化试剂是浓度为100mmol/L2-硝基苯甲醛，加入的体积与样品质量比为入3:40(mL:g)。进一步，所述步骤(1)中盐酸的浓度为0.5mol/L，加入的盐酸体积与样品的质量比为5:2(mL:g)。(2)提取和净化向步骤(1)处理后的样品中加入磷酸氢二钾溶液，使样品溶液的pH在7.0～7.5，加入乙酸乙酯液液萃取，涡旋混匀后离心，取上清液转入在45℃下氮气吹干，加入5％甲醇水溶液涡旋振荡溶解残留物，转移至超滤离心管中，14000r/min离心后，供高效液相色谱-串联质谱仪测定；进一步，所述步骤(2)中加入的磷酸氢二钾溶液浓度为1.0mol/L，加入的体积与样品的质量比为3:1(mL:g)。2)结合态氨基脲的测定(1)样品分别用甲醇/水、甲醇和水洗涤游离态氨基脲；(2)然后按照上述步骤1)进行测定；3)标准曲线的绘制分别移取一定浓度的氨基脲标准溶液，除不加样品外，按照上述步骤1)中(1)和(2)的操作步骤进行样品水解和衍生化、提取和净化，然后进LC-MS/MS分析，绘制标准曲线；4)所用的仪器条件色谱条件如下：a)色谱柱：C18反相色谱柱，2.1mm×100mm，2.6～5μm；b)柱温：室温；c)流速：0.3mL/min；d)进样量：10μL；e)流动相：A：甲醇，B：2mmol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序见表1。表1流动相梯度洗脱条件质谱条件如下：电喷雾离子源；喷雾电压：5500V，正离子扫描；离子源温度：550℃，碰撞气：Medium；气帘气：30psi；雾化气：35psi；辅助加热气：35psi；离子模式：多反应选择监测，选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和锥孔电压质谱参数见表2；表2选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量注：*代表定量碎片离子5)定性与定量(1)定性测定在同样测试条件下，试样液中目标化合物的保留时间与标准工作液中目标化合物的保留时间之比，偏差在±5％以内，且检测到的定性离子的相对丰度，应与浓度相近的标准工作液中定性离子相对丰度一致，其偏差应符合表3要求；表3基峰与次强碎片离子丰度比要求(2)定量测定取试样溶液和相应的标准工作液，作多点校准，按内标法定量；标准溶液及试样溶液中目标化合物的响应值均应在仪器检测的线性范围之内；氨基脲以其同位素为内标进行定量；(3)空白实验除不加试样外，均按上述测定条件和步骤进行；(4)结果计算和表述按式(a)计算试样中目标化合物的残留量：式中：X—试样中目标化合物的残留量，μg/kg；C—试样溶液中目标化合物的浓度，ng/mL；V—最终样液定容体积，mL；f—稀释倍数；m—试样量，g；注：计算结果需扣除空白值；氨基脲总量、结合态氨基脲含量按照公式(a)计算得到，游离态氨基脲含量＝氨基脲总量-结合态氨基脲含量。本专利技术方法的灵敏度、准确度和精密度灵敏度：闭壳肌、外套膜、鳃、内脏、性腺中氨基脲的检出限均为0.5μg/kg，定量限为1.0μg/kg。准确度：本方法氨基脲在1.0μg/kg～10μg/kg添加浓度范围内，回收率为70％～120％。精密度：本方法的批内相对标准偏和批间相对标准偏差均≤15％。本专利技术与现有技术相比的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氨基脲在贝类组织中存在形态和含量的测定方法，其特征在于所述方法包括氨基脲总量的测定、结合态氨基脲、标准曲线的绘制、所用的仪器条件和定性与定量；具体步骤如下：/n1)氨基脲总量的测定/n(1)样品水解和衍生化/n样品中加入盐酸、衍生化试剂、SEM-

【技术特征摘要】
1.一种氨基脲在贝类组织中存在形态和含量的测定方法，其特征在于所述方法包括氨基脲总量的测定、结合态氨基脲、标准曲线的绘制、所用的仪器条件和定性与定量；具体步骤如下：
1)氨基脲总量的测定
(1)样品水解和衍生化
样品中加入盐酸、衍生化试剂、SEM-13C,15N2同位素内标，37℃水解和衍生化16h，取出放置至室温；
(2)提取和净化
向步骤(1)处理后的样品中加入磷酸氢二钾溶液，使样品溶液的pH在7.0～7.5，加入乙酸乙酯液液萃取，涡旋混匀后离心，取上清液转入在45℃下氮气吹干，加入体积比5％甲醇水溶液涡旋振荡溶解残留物，转移至超滤离心管中，14000r/min离心后，供高效液相色谱-串联质谱仪测定；
2)结合态氨基脲的测定
(1)样品分别用甲醇/水、甲醇和水洗涤游离态氨基脲；
(2)然后按照上述步骤1)进行测定；
3)标准曲线的绘制
分别移取一定浓度的氨基脲标准溶液，除不加样品外，按照上述步骤1)中(1)和(2)的操作步骤进行样品水解和衍生化、提取和净化，然后进LC-MS/MS分析，绘制标准曲线；
4)所用的仪器条件
色谱条件如下：
a)色谱柱：C18反相色谱柱，2.1mm×100mm，2.6～5μm；
b)柱温：室温；
c)流速：0.3mL/min；
d)进样量：10μL；
e)流动相：A：甲醇，B：2mmol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱程序见表1；
表1流动相梯度洗脱条件



质谱条件如下：
电喷雾离子源；喷雾电压：5500V，正离子扫描；离子源温度：550℃，碰撞气：Medium；气帘气：30psi；雾化气：35psi；辅助加热气：35psi；离子模式：多反应选择监测，选择反应监测母离子、子离子、碰撞能量和锥孔电压质谱参数见表2；
表2选择反应监...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢丽红，孙伟红，李兆新，孙晓杰，郭萌萌，朱盼盼，郑旭颖，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37