一种扩增PKD1基因的引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及遗传病基因检测领域，特别是涉及一种用于扩增PKD1基因的PCR引物组，所述PCR引物组包括第一引物对、第二引物对、第三引物对或第四引物对中的一对或几对。本发明专利技术的引物组延长了覆盖1号外显子的扩增子长度，成功实现对1号外显子区域的稳定扩增，扩增产物覆盖了PKD1全部外显子区域，及大部分内含子区域；特异性地获得PKD1基因序列，完全扩增不到PKD1的假基因序列；在完全排除假基因干扰的情况下，更加准确地检测PKD1基因的变异，包括已知变异和未知变异。

【技术实现步骤摘要】
一种扩增PKD1基因的引物组及试剂盒
本专利技术涉及遗传病基因检测领域，特别是涉及一种扩增PKD1基因的引物组及试剂盒。
技术介绍
多囊肾(polycystickidney)又名Potter(I)综合征、Perlmann综合征，先天性肾囊肿瘤病、囊胞肾、双侧肾发育不全综合征等，是一种较常见的遗传性疾病。主要表现为两侧肾病变进展不对称，大小有差异，至晚期两肾可占满整个腹腔，肾表面布有很多囊肿，使肾形不规则，凹凸不平，最终导致终末期肾病。多囊肾按遗传方式可分为常染色体显性(成人型)多囊肾病(autosomaldominantpolycystickidneydisease,ADPKD)和常染色体隐性(婴儿型)多囊肾病(autosomalrecessivepolycystickidneydisease,ARPKD)，其发病率分别为1/400～1/1000和1/10000～1/40000。ADPKD以常染色体显性方式遗传。成人型多囊肾主要是由PKD1和PKD2基因突变致病，PKD1中基因突变致病率约85％，而PKD2中基因突变致病率约15％，则PKD1是成人型多囊肾的主要致病基因，PKD1基因编码的蛋白为多囊蛋白1(PC1)。PKD1基因位于16号染色体短臂上，基因长52kb，共有46个外显子，PKD1基因在16号染色体上存在6个与其同源的假基因，假基因与PKD1基因1-33号外显子序列同源性高达97.7％，大约80％的致病突变发生在此区域，常规的PCR或二代测序等方法难以特异性地将PKD1真基因靶向富集并检测，检测结果的准确性往往受到假基因的干扰。而且PKD1部分DNA序列GC含量高，如1号外显子区域GC含量高达85％，利用PCR扩增或NGS等方法检测高GC含量的序列难度较高，很多利用PCR技术检测PKD1基因的试剂盒均只对第2-46号外显子进行扩增，无法检测1号外显子内的变异。PKD1无特定的突变位点，突变可能发生在任何部位，因此，全面地检测PKD1基因变异需要检测其所有外显子区域。现有的检测方法各有缺陷。比如，PKD1有46个外显子，分别扩增PKD1的每个外显子再进行一代测序，需要消耗较高的工作量和成本，并且难以特异性地扩增PKD1真基因，结果的准确性会受假基因序列的干扰；有文章中虽然无需分别扩增每个外显子但是扩增PKD1基因过程中所需要使用的引物组也过多，方法过于繁琐，检测效率低。或利用巢式PCR富集PKD1真基因，通常先用几段长片段PCR扩增PKD1基因，再以长片段PCR产物为模板，富集PKD1真基因，操作相对复杂；或利用二代测序方法检测PKD1，难以特异性地捕获PKD1真基因，并且二代测序读长较短，真假基因同源性高导致数据无法特异性地进行比对；或利用三代测序方法检测PKD1，成本相对较高。
技术实现思路
鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种扩增PKD1基因的引物组及试剂盒，用于解决现有技术中的问题。为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的用于扩增PKD1基因的PCR引物组，其特征在于，所述PCR引物组包括以下引物对中的一对或几对：1)第一引物对：包括核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的上游引物与核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的下游引物；2)第二引物对：包括核苷酸序列如SEQIDNO:3所示的上游引物与核苷酸序列SEQIDNO:4所示的下游引物；3)第三引物对：包括核苷酸序列如SEQIDNO:5所示的上游引物与核苷酸序列SEQIDNO:6所示的下游引物；4)第四引物对：包括核苷酸序列如SEQIDNO:7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO:8所示的下游引物。本专利技术的用于扩增PKD1基因的试剂盒包括第一引物对、第二引物对、第三引物对或第四引物对中的任一种或几种。本专利技术的用于扩增PKD1基因的扩增体系包括第一扩增体系、第二扩增体系、第三扩增体系和第四扩增体系，所述第一扩增体系包括所述第一引物对，第二扩增体系包括所述第二引物对，第三扩增体系包括所述第三引物对，第四扩增体系包括所述第四引物对。本专利技术的所述扩增PKD1基因的PCR引物组和/或所述扩增体系在制备检测PKD1基因变异产品中的用途。如上所述，本专利技术的扩增PKD1基因的引物组及试剂盒，具有以下有益效果：1)延长了覆盖1号外显子的扩增子长度，成功实现对极高GC含量的1号外显子区域的稳定扩增，扩增产物覆盖了PKD1全部外显子区域，及大部分内含子区域；2)一次性且特异性地获得PKD1基因序列，完全扩增不到PKD1的假基因序列；3)在完全排除假基因干扰的情况下，更加准确地检测PKD1基因的变异，包括已知变异和未知变异。附图说明图1为PKD1四个扩增子长片段PCR扩增产物电泳质检图，注：M为1kbExtendDNALadder，片段长度由上而下依次为48.5kb，20kb，15kb，10kb，8kb，6kb，5kb，4kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，0.5kb；1号代表PKD1-F1/R1扩增产物，大小为14693bp、2号代表PKD1-F3/R3扩增产物，大小为13453bp、3号代表PKD1-F2/R2扩增产物，14394bp、4号代表PKD1-F4/R4扩增产物，大小3930bp。图2为PKD1四个扩增子对应文库质检图，M为2000bpMarker，片段长度由上而下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，编号1、2、3、4分别对应扩增子1、2、3、4文库质检图。图3显示为1号扩增子中chr16:2148504位点上下游真基因与假基因的序列比对情况。图4显示为原始bam文件中，chr16:2148504位点(左起第一个框)由A突变为G，上游两个真假基因不一致的位点(分别用左起第二个框进而第三个框标注)并未发生突变。图5显示为chr16:2163303-2178540区域内真假基因比对图示。图6显示为chr16:2163303-2178540区域内的原始bam序列，方框标出的位置为假基因特异位点。图7显示为chr16:2177877-2186230区域内真假基因比对图示。图8显示为chr16:2177877-2186230区域内的原始bam序列，方框标出的位置为假基因特异位点。具体实施方式本专利技术提供用于扩增PKD1基因的PCR引物组，所述PCR引物组包括以下引物对中的一对或几对：1)第一引物对：包括核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的上游引物与核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的下游引物；2)第二引物对：包括核苷酸序列如SEQIDNO:3所示的上游引物与核苷酸序列SEQIDNO:4所示的下游引物；3)第三引物对：包括核苷酸序列如SEQIDNO:5所示的上游引物与核苷酸序列SEQIDNO:6所示的下游引物；4)第四引物对：包括核苷酸序列如SEQIDNO:7所示的上游引物和核苷酸序列如SE本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于扩增PKD1基因的PCR引物组，其特征在于，所述PCR引物组包括以下引物对中的一对或几对：/n1)第一引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的上游引物与核苷酸序列如SEQID NO:2所示的下游引物；/n2)第二引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的上游引物与核苷酸序列SEQ IDNO:4所示的下游引物；/n3)第三引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的上游引物与核苷酸序列SEQ IDNO:6所示的下游引物；/n4)第四引物对：包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQID NO:8所示的下游引物。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于扩增PKD1基因的PCR引物组，其特征在于，所述PCR引物组包括以下引物对中的一对或几对：
1)第一引物对：包括核苷酸序列如SEQIDNO:1所示的上游引物与核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的下游引物；
2)第二引物对：包括核苷酸序列如SEQIDNO:3所示的上游引物与核苷酸序列SEQIDNO:4所示的下游引物；
3)第三引物对：包括核苷酸序列如SEQIDNO:5所示的上游引物与核苷酸序列SEQIDNO:6所示的下游引物；
4)第四引物对：包括核苷酸序列如SEQIDNO:7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQIDNO:8所示的下游引物。


2.根据权利要求1所述的PCR引物组，其特征在于，所述PCR引物组还包括以下特征中的一项或几项：
1)第一引物对扩增的区域中包括PKD1基因24-46号外显子；
2)第二引物对扩增的区域中包括PKD1基因15-33号外显子；
3)第三引物对扩增的区域中包括PKD1基因2-15号外显子；
4)所述第四引物对扩增的区域中包括PKD1基因1号外显子。


3.根据权利要求1所述的PCR引物组，其特征在于，所述PKD1基因为人PKD1基因。


4.用于扩增PKD1基因的扩增体系，其特征在于，所述扩增体系包括第一扩增体系、第二扩增体系、第三扩增体系和第四扩增体系，所述第一扩增体系包括所述第一引物对，第二扩增体系包括所述第二引物对，第三扩增体系包括所述第三引物对，第四扩增体系包括所述第四引物对。


5.根据权利要求4所述的扩增体系，其特征在于，所述扩增体系还包括以下特征中的一项或几项：
1)所述第四扩增体系包括下述成分：总量为50～150ng的DNA模板、终浓度为150～300nM的第四引...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨敬敏，朱学萍，王彬，唐嘉婕，高鹏飞，林健，
申请(专利权)人：上海韦翰斯生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31