一种提高脐带间充质干细胞原代获取的方法技术

本发明专利技术实施例公开了一种提高脐带间充质干细胞原代获取的方法，属于干细胞的分离和培养方法，包括铺板、补液、换液等步骤，在为37℃、5％CO

【技术实现步骤摘要】
一种提高脐带间充质干细胞原代获取的方法
本专利技术涉及一种干细胞的分离和培养方法，尤其涉及一种提高脐带间充质干细胞原代获取的方法。
技术介绍
近年来，细胞药物研发成为药品研发的热点，不同来源的干细胞在国外已有上市药物。脐带间充质干细胞的获取和扩增技术，已有成熟的研究体系和应用，但稳定大量的规模化制备仍然是商业化生产需要解决的难点，尤其是在原代细胞获取阶段。目前原代细胞获取的方法主要有两种，酶解法和爬瓶法。酶解法方法操作步骤较多，涉及多种仪器间的来回穿插，生产控制风险大；涉及到的生物酶，对细胞损伤难以评估，引入的生物活性物质残留难以检测，生物反应器来源大多为大肠杆菌等微生物，造成安全性风险增加。在制药行业中，对生产用原材料的控制使得这种方法应用并不广泛。爬瓶法生产所采用的培养容器多为培养皿或带透气盖培养瓶，培养皿操作简单方便，但由于其开口大，且无法密封导致操作、转移和培养过程极易发生微生物污染；培养瓶则较好的降低了污染风险，但由于敞口变小，操作难度也相应增加。爬瓶法的爬出率和爬出量难以稳定，主要原因是细胞在华通胶组织中分布是不均匀的，该法不能够帮助提高细胞贴壁增殖，导致爬瓶法一般原代获取量一般小于酶解法且稳定不高。近年某些生物器械厂家也推出了一些能够自动化处理脐带的器械。这些仪器普遍功能较少，仅作用于原代操作的某个阶段，例如对获得的华通胶进行操作，通量较小，单次脐带处理量较低，单次处理长达数个小时，价格较高，单台仪器超过10万元，某些仪器仍然需要联合生物酶才能发挥较好的作用，不适合在规模化制备上进行应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术中干细胞原代获取量小、污染风险大的技术问题，提供一种提高脐带间充质干细胞原代获取的方法，基于爬瓶法进行优化和调整，使污染风险更小，原代获取量大大增加，且不引入风险评估困难的成分，使安全性提高，生产控制更容易。本专利技术提供的技术方案如下：一种提高脐带间充质干细胞原代获取的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)铺板：取组织块接种于细胞培养瓶，加入原代培养液，使组织块较均匀地贴附于细胞培养瓶表面；(2)补液：培养3～7天后取出细胞培养瓶，补加37℃水浴预热后的原代培养液2～10mL，继续培养3～7天；(3)换液：吸出培养废液，每瓶加入原代培养液10mL，继续培养，当不低于10个组织块且每个组织块40x放大至少1个视野的细胞爬出情况达到如下条件可进行传代：每个细胞瓶中成功爬出的组织块数量＞15个，每个组织块细胞爬出量可占满一个40×视野。优选的，所述步骤(1)中接种组织块的量为0.25～0.75ml，接入培养液的量为2～12ml。优选的，所述培养环境均为37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养。优选的，原代细胞获取方法包括如下步骤：A清洗：将组织块拨下，连同培养废液倒出，使用清洗液润洗细胞面2次，每次10mL，注意加液时不得直接冲洗细胞生长的表面；B消化：加入2mL消化液，显微镜下观察，待细胞间出现裂隙并开始皱缩时，加入2mL终止液终止消化；C离心计数：细胞悬液270×g离心5min，弃上清液，细胞沉淀重悬后得原代细胞(P0)。优选的，所述消化液为GibcoTryPLETM胰酶替代物，所述终止液为人血白蛋白。优选的，在进行铺板前先进行脐带处理，所述脐带处理包括如下步骤：a清洗：将脐带在150mm培养皿中用镊子挤出残留血液，使用清洗液清洗3次及以上，每次不低于20mL，至无明显血色，用剪刀将脐带剪成1～3cm的小段；b剔除：使用剪刀剪开静脉血管，用镊子轻轻刮除静脉血管壁；找出两根动脉血管并剔除；用镊子将华通胶撕下，置于含20mL原代培养液的50mL的离心管中。c剪碎：加入清洗液清洗3次，每次不低于20mL，1200rpm离心5min，弃上清，用眼科剪剪碎成约1-2mm3的组织块。通过采用上述技术方案，达到的技术效果如下：本专利技术方法简单，污染风险低，原代获取量大大增加，且形态好，克隆率高。附图说明图1是不同原代获取方法的效果比较图，a为组织块贴壁法，b为胶原酶消化法，c为复合胶原酶消化法；图2是不同原代获取方法的细胞传代效果比较图，A为组织块贴壁法，B为胶原酶消化法，C为复合胶原酶消化法。具体实施方式为了更进一步理解本专利技术技术方案，现结合实例予以说明。实施例首先先对脐带进行处理，所述脐带处理包括如下步骤：a清洗：将脐带在150mm培养皿中用镊子挤出残留血液，使用清洗液清洗3次及以上，每次不低于20mL，至无明显血色，用剪刀将脐带剪成1～3cm的小段；b剔除：使用剪刀剪开静脉血管，用镊子轻轻刮除静脉血管壁；找出两根动脉血管并剔除；用镊子将华通胶撕下，置于含20mL原代培养液的50mL的离心管中。c剪碎：加入清洗液清洗3次，每次不低于20mL，1200rpm离心5min，弃上清，用眼科剪剪碎成约1-2mm3的组织块。其次对组织块进行培养，包括如下步骤：(1)铺板：取0.5ml组织块接种于细胞培养瓶，加入10ml原代培养液，使组织块较均匀地贴附于细胞培养瓶表面，在37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养；(2)补液：培养7天后取出细胞培养瓶，补加37℃水浴预热后的原代培养液8mL，继续培养7天；(3)换液：吸出培养废液，每瓶加入原代培养液10mL，继续培养，当不低于10个组织块且每个组织块40x放大至少1个视野的细胞爬出情况达到如下条件可进行传代：每个细胞瓶中成功爬出的组织块数量＞15个，每个组织块细胞爬出量可占满一个40×视野。最后，获取原代细胞，获取方法包括如下步骤：A清洗：将组织块拨下，连同培养废液倒出，使用清洗液润洗细胞面2次，每次10mL，注意加液时不得直接冲洗细胞生长的表面；B消化：加入2mLGibcoTryPLETM胰酶替代物消化液，显微镜下观察，待细胞间出现裂隙并开始皱缩时，加入2mL人血白蛋白终止液终止消化；C离心计数：细胞悬液270×g离心5min，弃上清液，细胞沉淀重悬后得原代细胞(P0)。对照例目前文献报道的和常用的脐带原代处理方法主要分为3种：组织块贴壁培养法，胶原酶消化法和复合胶原酶消化法[尹富华,杨晓凤,黄胜男,etal.人脐带间充质干细胞3种分离制备方法的比较[J].临床检验杂志，2010，028(006):413-414.]。组织块贴壁培养法是一种组织块自然爬出的方法。胶原酶消化法是一种将脐带组织块使用酶消化，使组织块细胞消化成一个个小的细胞或细胞团，继续扩增从而获得原代细胞的方法。复合胶原酶消化法是在胶原酶消化法的基础上，增加酶种类进行消化，从而达到更好的获取效率和质量的方法。据文献的对比实验结果，同等条件下的胰酶消化法未能成功分离培养出MSCs。原因可能是脐带组织成分和含量复杂，酶难以将其消化或消化过程可控性差导致分离稳定性差。[窦慧慧本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高脐带间充质干细胞原代获取的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)铺板：取组织块接种于细胞培养瓶，加入原代培养液，使组织块较均匀地贴附于细胞培养瓶表面；/n(2)补液：培养3～7天后取出细胞培养瓶，补加37℃水浴预热后的原代培养液2～10mL，继续培养3～7天；/n(3)换液：吸出培养废液，每瓶加入原代培养液10mL，继续培养，当不低于10个组织块且每个组织块40x放大至少1个视野的细胞爬出情况达到如下条件可进行传代：每个细胞瓶中成功爬出的组织块数量＞15个，每个组织块细胞爬出量可占满一个40×视野。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高脐带间充质干细胞原代获取的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)铺板：取组织块接种于细胞培养瓶，加入原代培养液，使组织块较均匀地贴附于细胞培养瓶表面；
(2)补液：培养3～7天后取出细胞培养瓶，补加37℃水浴预热后的原代培养液2～10mL，继续培养3～7天；
(3)换液：吸出培养废液，每瓶加入原代培养液10mL，继续培养，当不低于10个组织块且每个组织块40x放大至少1个视野的细胞爬出情况达到如下条件可进行传代：每个细胞瓶中成功爬出的组织块数量＞15个，每个组织块细胞爬出量可占满一个40×视野。


2.根据权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞原代获取的方法，其特征在于，所述步骤(1)中接种组织块的量为0.25～0.75ml，接入培养液的量为2～12ml。


3.根据权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞原代获取的方法，其特征在于，所述培养环境均为37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱中培养。


4.根据权利要求1所述的提高脐带间充质干细胞原代获取的方法，其特征在于，原代细胞获取方法包括如下步骤：
A清洗：将组织块拨下，连同培养废液倒出...

【专利技术属性】
技术研发人员：强斌，廉云飞，
申请(专利权)人：江苏拓弘康恒医药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32