益生菌青春双歧杆菌菌株制造技术

本发明专利技术涉及分离菌株，其能够i)在10h处理之后将Caco‑2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER；ii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时，诱导IL‑10分泌>200pg/ml；和/或iii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL‑10:IL‑12比率>1。本发明专利技术还涉及这些菌株用于改善肠道屏障功能、引发抗炎免疫应答和预防、减轻症状、以及治疗具有潜在受损的肠道屏障功能和粘膜的促炎激活的疾病或病状的用途。

【技术实现步骤摘要】
益生菌青春双歧杆菌菌株本申请是申请日为2015年8月28日、申请人为科.汉森有限公司、专利技术名称为“益生菌青春双歧杆菌菌株”的中国专利申请201580045802.7的分案申请。
本专利技术涉及青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)的新型分离菌株，其能够i)在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER；ii)诱导IL-10分泌>200pg/ml；和/或iii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10:IL-12比率>1。所述菌株可具有这些能力中的一种、两种或所有三种。此外，本专利技术涉及这些菌株用于改善肠道屏障功能和/或引发抗炎免疫应答的用途。本专利技术的一个实施方案涉及一种青春双歧杆菌菌株，其发酵D-核糖，不发酵D-山梨糖醇，并且具有包含以下的16S核糖体基因序列：SEQIDNO:1或2；SEQIDNO:3、4或5；SEQIDNO:6、7、8或9；以及SEQIDNO:10或11。
技术介绍
双歧杆菌是胃肠道的天然栖居者，其具有遗传适应性使其能够定殖此苛刻且复杂的生境。双歧杆菌与肠道功能的关键要素相互作用并且有助于维持体内平衡。近期的科学进展显示双歧杆菌通过与宿主的菌株依赖性相互作用可降低粘膜抗原负载，改善肠道屏障并且诱导局部和全身免疫应答的调节。由于其对人类健康公认的益处，双歧杆菌被用作益生菌。益生菌是“活的微生物，当其以足量施用时，向宿主提供健康益处”(FAO/WHO,2001)。可商购获得约一打具有临床上记录的效果的双歧杆菌属菌株。这些中的一半是动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)菌株并且其余是长双歧杆菌长亚种(Bifidobacteriumlongumsubsp.longum)、长双歧杆菌婴儿亚种(B.longumsubsp.infantis)、或短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)菌株。青春双歧杆菌的模式菌株(ATCC15703T)是从成人的肠道中分离(Reuter,1971)。青春双歧杆菌菌株经常在成人肠道中检测到(Turroni等人,2009)。肠道上皮是覆盖小肠和大肠的柱状且无纤毛的细胞层。肠道上皮层构成了针对外界环境的最大且最重要的屏障并且维持上皮完整性对保持健康必不可少。上皮衬层是由被由特化的杯状细胞产生的多层粘液覆盖的单层上皮细胞组成。在上皮细胞下面是含有多种免疫细胞的固有层(肠相关淋巴组织；GALT)。上皮细胞通过其中紧密连接(TJ)在防止分子进入细胞之间的上皮中起主要作用的细胞连接结合在一起。TJ负责限制蛋白质、脂质及小溶质的细胞旁(细胞之间)扩散。因此，在健康上皮中，仅水和小分子(离子)细胞旁渗透，而较大分子的转运是通过细胞摄取机制来调节。TJ是由跨越两个邻近肠道上皮细胞之间的空间的蛋白质组成。TJ是参与发育、生理及病理过程的动态结构。各种应激物可致使TJ削弱，由此增强分子向粘膜中的细胞旁(未经调节的)转运。受损的肠道屏障功能的特征是肠粘膜对腔内大分子、抗原及毒素的渗透性增加，由此可引起粘膜的发炎、变性和/或萎缩。此病状，有时称为‘肠漏综合征’，取决于严重性而与许多症状有关。来源于肠道中的革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)是非常有效的免疫应答激活剂。一旦粘膜免疫系统被激活，促炎介质便加剧TJ的开放，从而导致增加的渗透性和发炎的恶性循环。已显示益生菌菌株在体外(Anderson等人,2010；Karczewski等人,2010；Liu等人,2010a；Liu等人,2010b；Donato等人,2010)、在小鼠模型中(Generoso等人,2010；Liu等人,2011；Miyauchi等人,2009)、以及在人中(Karczewski等人,2010)降低肠上皮渗透性。已经发现了体外与体内结果之间的一般良好一致性。参与屏障功能的益生菌改善的机制包括TJ蛋白的增加表达，如闭合蛋白(occludin)、密封蛋白(claudin-1)、F11受体(F11R)及闭锁小带1(ZO-1)和2(Anderson等人,2010；Liu等人,2010a；Liu等人,2010b；Miyauchi等人,2009；Ukena等人,2007。闭合蛋白和ZO-1向TJ结构附近的增加定位见于用植物乳杆菌WCFS1(Karczewski等人,2010)或鼠李糖乳杆菌LGG(Donato等人,2010)处理的人活体组织活检(Karczewski等人,2010)以及Caco-2单层中，可能涉及Toll样(TLR)受体2信号传导(Karczewski等人,2010)。在坏死性小肠结肠炎(NEC)的新生小鼠模型中，发现肠道渗透性增加先于NEC，而婴儿双歧杆菌BB-02施用削弱了肠道渗透性增加，保留闭合蛋白及密封蛋白2和4在TJ处的定位，并且降低NEC发病率(Bergmann等人,2013)。与小鼠中的结肠炎有关的肠道渗透性增加通过益生菌(VSL#3)抵消闭合蛋白、ZO-1、以及密封蛋白-1、-3、-4及5的表达减少和再分布而得以完全预防(Mennigen等人,2009)。所提出的细菌信号组分包括植物乳杆菌表层蛋白质(Liu等人,2010a)和吲哚(Bansal等人,2010)。在体内，屏障功能可通过各种非侵入性测定法通过施用大丸剂的例如CrEDTA或两种非代谢糖(例如，乳果糖和甘露糖醇)接着分别测定在尿中的Cr或两种糖的比率来测量。甘露糖醇是单糖且因此容易吸收并充当跨细胞摄取的标记物，而二糖的乳果糖通过细胞衬里被排除且由此仅稍微吸收并充当粘膜完整性的标记物。乳果糖和甘露糖醇测试由于糖在大肠中的细菌分解而提供仅与小肠有关的完整性信息，而CrEDTA更稳定并优先提供有关结肠上皮的信息，因为这里是化合物存在时间最久的地方(Arrieta等人,2006)。不足的肠道屏障功能与肠道及全身临床表现有关。肠道渗透性在炎性肠病(IBD)和肠易激综合征(IBS)的情形中被研究得最广泛。炎性肠病(IBD；克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)的特征是慢性复发性肠炎，伴有先天和适应性免疫系统的参与(Zhang和Li,2014)。涉及细胞因子白介素23(IL-23)和T辅助17(TH17)细胞的促炎途径在患有溃疡性结肠炎和克罗恩氏病的患者中是增加的(Song等人,2013)，这得到了提示IL23R基因中的基因变体与IBD之间的关联的遗传研究的支持(Beaudoin等人,2013)。IBD的病因学是未知的，但在IBD中存在肠道屏障功能受损的广泛支持数据(Gecse等人,2011；Gerova等人,2011；Odenwald和Turner,2012)。在具有活动性疾病的克罗恩氏病患者中发现肠道渗透性提高(Ukabam等人,1983)并且患有克罗恩氏病的患者的10-20％的健康亲属具有增加的渗透性(Hollander等人,1986)。IBD发病机理的一个理论提示增加的肠道渗透性将下层的GALT暴露于通常被排除的物质，由此产生自身延续性炎症过程(Poritz等本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离菌株，其选自由以下组成的组：DSM 29104、DSM 29106、DSM 29107、DSM29111、DSM 29102及DSM 29105以及能够实现以下各项的上述保藏菌株的任一种的突变体：/ni)在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER；/nii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时，诱导IL-10分泌>200pg/ml；和/或/niii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10:IL-12比率>1。/n

【技术特征摘要】
20140829 EP 14182859.01.一种分离菌株，其选自由以下组成的组：DSM29104、DSM29106、DSM29107、DSM29111、DSM29102及DSM29105以及能够实现以下各项的上述保藏菌株的任一种的突变体：
i)在10h处理之后将Caco-2细胞单层的跨上皮电阻(TER)增加至大于120％处理开始时的TER；
ii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时，诱导IL-10分泌>200pg/ml；和/或
iii)当与源自人PBMC的树突细胞共培育时诱导IL-10:IL-12比率>1。


2.根据权利要求1所述的分离菌株，其选自由以下组成的组：DSM29104、DSM29106、DSM29107、DSM29111、DSM29102及DSM29105。


3.一种益生菌产品，其包含根据权利要求1或2所述的分离菌株和冷冻保护剂。


4.根据权利要求3所述的益生菌产品，其中所述冷冻保护剂是糖。


5.根据权利要求1或2所述的分离菌株或根据权利要求3或4所述的益生菌产品在制备用于改善肠道屏障功能的组合物中的用途。


6.根据权利要求1或2所述的分离菌株或根据权利要求3或4所述的益生菌产品在制备用于改善肠道屏障功能的膳食补充剂中的用...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯·达尔曼·莱泽，D·迈林格彼得森，J·E·克里斯滕森，A·韦勒朱斯，E·布罗克曼，
申请(专利权)人：科汉森有限公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK