一种SOD融合蛋白脂质体与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种SOD融合蛋白脂质体与应用。所述SOD融合蛋白的脂质体平均粒径范围为100~400 nm，表面电荷范围在‑10~‑50mV。SOD融合蛋白的脂质体能较好地抵抗胃酶和胰酶的酶解破坏。本发明专利技术涉及的SOD融合蛋白的脂质体的原料中，SOD融合蛋白的来源于重组毕赤酵母胞外表达，酶活力高，纯化工艺简单，易获得；大豆卵磷脂和胆固醇均属于食物中常见的化学成分，来源广，安全性高。其脂质体的制备方法利用逆向蒸发法。本发明专利技术涉及的SOD融合蛋白脂质体有望应用于清除肠道自由基，修复氧化应激造成的溃疡性结肠炎损伤。

【技术实现步骤摘要】
一种SOD融合蛋白脂质体与应用
本专利技术涉及食品与医药
中的蛋白质新剂型和制剂技术，具体涉及到一种SOD融合蛋白脂质体及其在溃疡性结肠炎中的应用。
技术介绍
超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD）是人体内抗氧化系统的核心分子，因为它能够高效地清除人体内最基本的氧自由基——超氧阴离子自由基（O2·-）。SOD可于治疗由氧自由基异常增高引起的各种疾病，如衰老、辐射病。但SOD临床应用仍受到限制，因为SOD在血液中半衰期短，具有免疫原性，产生致敏性，易酶解失活，贮存过程中不稳定等。为克服局限，研究学者对SOD分子的修饰、改造等方面的技术虽然已取得了无数的成果，但是由于天然SOD本身的理化性质所限，故改善SOD特性的方法需要进一步的研究探索。氨基酸序列为YGRKKR的短肽富含碱性氨基酸，通过基因工程将YGRKKR短肽与Cu/ZnSOD结合的SOD融合蛋白（以下简称SOD-YR），它比SOD稳定并具有更好的细胞粘附性和跨膜能力。脂质体是由脂双层膜形成的球形囊泡，主要成分为磷脂和胆固醇。脂双层膜具有类似于细胞膜的磷脂双分子层结构，可将脂溶性药物包封在脂双层膜内，或将水溶性药物包封在亲水中心，达到包埋药物的目的。由于脂质体的成分与细胞膜相似，脂质体更容易被细胞膜融合和内吞。脂质体作为药物载体，具有生物相容性好、安全无毒、免疫原性低、可降解、缓释控释等优点，能提高药物在体内的稳定性、降低毒副作用、提高和延长药物疗效等。因此，脂质体被认为是提高药物应用性能最成功的载药系统之一。脂质体的制备方法有很多种。薄膜合成法和逆向蒸发法是目前较为传统、应用较广的两种脂质体制备方法。其它方法包括冷冻干燥法、乙醇注射法等等。其中，逆向蒸发法，基于“反胶束”的形成，适合包封水溶性的药物，缺点是药物需要和有机溶剂直接接触。SOD-YR是水溶性蛋白质，而且具有较好的热稳定性，其酶活力不受乙醚等有机溶剂的影响，因此更适合采用逆向蒸发法来制备SOD融合蛋白脂质体（SOD-YR脂质体）。溃疡性结肠炎（UC）是结肠的一种慢性特发性炎症性肠病，会造成患者腹泻、便血、腹痛，甚至会进一步演变为结肠癌，这对人们的生活造成了极大的困扰和负担。活性氧（ROS）是促进UC发生和发展的重要原因。过量的ROS会造成生物分子（如磷脂、蛋白质、核酸等）的氧化损伤，还可以参与多种炎症反应。因此，多种抗氧化剂被用于治疗UC（如N-乙酰半胱氨酸、多酚类化合物等）。但是，它们多数是非特异性的且具有某些副作用，如引起恶心、呕吐，甚至肾脏损伤等。而超氧化物歧化酶(SOD)是人体内抗氧化系统的核心分子，它能够高效专一地清除人体内最基本的ROS——超氧阴离子自由基（O2·-）且未发现副作用，因此，SOD有望用于UC的治疗。SOD-YR中融合YGRKKR短肽可提高SOD的细胞粘附能力，延长其作用时间。脂质体包埋可提高SOD对胃酸、胃蛋白酶的耐受性，因此，口服SOD-YR脂质体有望为UC的治疗提供新的选择。目前还没SOD-YR脂质体（简称L-SOD-YR）的制备与研究的相关报道；参照已有文献进行制备时，可能存在包埋率低、SOD-YR的酶活力显著下降、脂质体在胃液中不稳定、在肠液中释放率低等问题。本专利技术通过优化实验，选用合适比例的SOD-YR、大豆卵磷脂和胆固醇为原料，采用逆向蒸发法，制备SOD-YR脂质体。SOD-YR脂质体平均粒径范围为100-400nm，特别是200-300nm；表面电荷呈负性，范围在-10~-50mV。并通过与单纯的SOD融合蛋白（SOD-YR）、SOD脂质体（L-SOD）的比较实验，确定SOD-YR脂质体可用于清除肠道自由基，修复氧化应激造成的溃疡性结肠炎损伤。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种SOD-YR脂质体及其制备方法。考虑到应用的安全问题，本专利技术涉及的SOD-YR脂质体的制备考虑了两大因素：一是大豆卵磷脂和胆固醇属于食物中常见的化合物，对人体无毒害作用；二是该脂质体的逆向蒸发过程使用极易挥发乙醚作为有机溶剂，在40℃蒸发时能充分去除。本专利技术得到的SOD-YR脂质体粒径、电位分布较为集中，稳定性好，且具有较好的消化耐受性。并将制备好的SOD-YR脂质体用于清除肠道自由基，修复氧化应激造成的溃疡性结肠炎损伤。为实现上述目的，本专利技术可以采用如下技术方案：一种SOD-YR脂质体，所述的SOD-YR脂质体含有SOD-YR、大豆卵磷脂和胆固醇，其中，SOD-YR和大豆卵磷脂质量之比为1:10-1:50；大豆卵磷脂质量和胆固醇质量之比为1:1-5:1。所述SOD-YR纳米颗粒平均粒径范围为100-400nm；表面电荷呈负性，范围在-10~-50mV。该SOD-YR脂质体其酶活力范围为1000~20000U/mL。所述SOD-YR（SOD融合蛋白）是Cu/ZnSOD和序列为YGRKKR短肽融合而成的蛋白，该融合蛋白其氨基酸序列为ATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQYGRKKR。一种SOD-YR脂质体，由重组毕赤酵母表达获得的SOD-YR、大豆卵磷脂和胆固醇经过逆向蒸发法制备：将大豆卵磷脂与胆固醇以1:1-5:1（m/m）加入到装有15~30mL乙醚的茄型瓶中充分溶解，获得有机相。再将溶有1~100mg的SOD-YR的4mMPBS溶液（pH7.4）5~10mL加入到以上有机相中，然后常温水浴超声（100W）处理4-6分钟。将超声处理形成的乳液置于40℃水浴中，并经过真空旋转蒸发充分去除有机相。将所得的乳浊液，8000g·min-1，离心5min，弃去下层未形成脂质体的脂质残块，取上层溶液即可得到SOD-YR脂质体。所述的SOD-YR脂质体在制备去除自由基的药品或食品中的应用。所述的SOD-YR脂质体在制备抗溃疡性结肠炎的药品或者食品中的应用。作为辅助抗溃疡性结肠炎的食品或者药品时，使用剂量为3000-30000酶活力单位/公斤体重/天；1天给药一次，连续3-10天。采用盐酸羟胺法、动态光散射技术、体外模拟消化处理法对SOD-YR脂质体进行性质研究。实验制备所得的SOD-YR脂质体的的包封率范围为20~95%，在模拟胃液中，SOD-YR脂质体的酶活回收率为80%左右，在模拟肠液中，SOD-YR脂质体释放出90%以上的酶活力。本专利技术的优点在于：本专利技术涉及的SOD-YR脂质体中SOD-YR来源于重组毕赤酵母发酵表达，酶活高且容易纯化获得；大豆卵磷脂和胆固醇属于食物中常见的化合物，安全性高。其SOD-YR脂质体的制备方法中，逆向蒸发过程使用极易挥发乙醚作为有机溶剂，乙醚在40℃蒸发时能充分去除，安全性高。本专利技术得到的SOD-YR脂质体具有活性，粒径分布均匀，稳定性好，有良好的消化耐受性。涉及的SOD-YR脂质体可用于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种SOD融合蛋白脂质体，其特征在于：所述SOD融合蛋白是Cu/Zn SOD和氨基酸序列为YGRKKR的短肽融合而成的蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列为/nATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQYGRKKR。/n

【技术特征摘要】
1.一种SOD融合蛋白脂质体，其特征在于：所述SOD融合蛋白是Cu/ZnSOD和氨基酸序列为YGRKKR的短肽融合而成的蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列为
ATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQYGRKKR。


2.根据权利要求1所述SOD融合蛋白脂质体，其特征在于：所述脂质体在液体中的平均粒径范围为100~400nm；表面电荷呈负性，范围在-10~-50mV。


3.根据权利要求1所述的SOD融合蛋白脂质体，其特征在于：所述SOD融合蛋白的脂质体中还含有大豆卵磷脂和胆固醇。


4.根据权利要求3所述的SOD融合蛋白脂质体，其特征在于：S...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘树滔，周建森，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建;35