基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法，通过叶绿素荧光成像系统获取接菌不同天数的及未接菌绿豆叶片的叶绿素荧光参数，利用主成分分析(PCA)进行降维处理，选择解释率超99％的主成分作为输入，建立三次多项式支持向量机(Cubic Support Vector Machine，Cubic‑SVM)检测模型。本发明专利技术可以实现绿豆叶斑病的早期检测，且具有快速精准、无损且操作简便等优点，可为农业生产中精准防治该病害提供参考。

【技术实现步骤摘要】
基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法
本专利技术涉及农作物病害无损检测领域，特别是涉及一种基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法。
技术介绍
绿豆叶斑病是我国及亚洲地区绿豆生产上危害最严重的真菌病害之一，该病害是由变灰尾孢菌(CercosporacanescensEll.etMartin)引起的，病原菌主要侵染植株的叶片，以开花结荚期受害最严重。病害的发展一般分为侵入期、潜育期、发病期三个阶段，若可以在发病早期及时检测到病害，适时施药，可以有效地阻止病害的扩展，减少农药施用和环境破坏。传统的病害检测在实际的农业生产中有很多的不足。肉眼观测无法准确客观的对植物病害作出评价，且难以成规模的检测。光学显微镜技术、透射电子显微镜技术、生物测定技术、血清学技术、PCR技术等虽然能够进行精确的检测，但是需要专业人员操作，且费时费力，因此这些技术难以应用到实时的农田病害在线检测。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种基于叶绿素荧光成像技术的绿豆叶斑病早期检测方法，方法中Cubic-SVM算法模型预测精度较高，提供了一种绿豆叶斑病的早期快速无损检测手段。技术方案：本专利技术关于一种基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法，包括如下步骤：(1)选取同等种植条件下的绿豆植株，并设置试验组和对照组，试验组在复叶期进行致病菌菌丝块接种；对照组为未接菌绿豆植株；其中，试验组接种包括在绿豆长出第一组复叶时，选择健康复叶进行变灰尾孢菌菌丝块的接种；(2)采用叶绿素荧光成像系统(FluorCamFC800)获取试验组和对照组的叶绿素荧光数据；其中，荧光成像前对植株进行暗处理，暗处理时间大于25分钟；且分别取试验组接种1天、2天、3天及相应对照组的绿豆叶片进行数据获取。(3)采用主成分分析(PCA)的方法对数据进行降维处理，以主成分分析降维后的数据作为输入进行模型训练；(4)对试验样本获取的响应最敏感的荧光参数和荧光图像随接种天数的变化趋势进行了分析；(5)利用MATLAB2019a软件ClassificationLearner工具箱构建绿豆叶斑病机器学习模型，采用Cubic-SVM算法模型对采集的叶绿素荧光数据进行训练及预测。其中，步骤(1)中，绿豆统一种植在温度和湿度可控的人工气候室中。接种用变灰尾孢菌菌块先在V8培养基上28℃培养7d。接菌时，利用无菌的6mm打孔器取新鲜培养的变灰尾孢菌边缘部分，将菌丝一面贴于绿豆叶片的中央且偏离叶脉的位置。最后将接种好的绿豆植株移至25℃人工气候室并进行保湿处理，保证叶片发病条件。本专利技术主要检测在绿豆叶片未形成明显可见病斑及可见微小病斑时期，采用接种后1、2、3d的绿豆叶片各150片及正常未接种叶片100片作为供试样本。步骤(2)中，本系统中荧光成像前需要对植株进行充分的暗处理(25min以上)，保证光合反应中心PSII处于完全开放状态，叶绿素中的原初电子受体完全失去电子，处于最大氧化态。测量过程中，通过FluorCam7控制成像系统，将光化光阶段的光强设置为200μmol·m-2·s-1，设置饱和光强为1500μmol·m-2·s-1。开始测量后，灯源发出光强为0.1μmol·m-2·s-1的测量光闪，测量出叶片的最小荧光(Fo)。随后灯光发出第一个饱和光闪，叶片立刻被激发出最大荧光(Fm)，随后荧光强度猝灭到最小荧光附近。测量期间，测量光频率变为每2s一次进行测量，初始升高的最大荧光为Kautsky诱导效应下最大荧光(thepeakriseinfluorescence，Fp)。系统共开启5次饱和光闪，前4次饱和光闪获取光适应下的瞬时荧光(theinstantaneousfluorescenceduringlightadaptation，Ft-Ln)和光适应最大荧光(themaximumfluorescenceduringlightadaptation，Fm-Ln)。在第5次的饱和光闪下得出光适应稳态荧光(thesteady-statefluorescenceinlight，Ft-Lss)和光适应稳态最大荧光(thesteady-statemaximumfluorescenceinlight，Fm-Lss)。之后进入暗驰豫阶段，暗驰豫阶段测量共发出三次饱和光闪，间隔时长为3s。测量得到暗驰豫即时荧光(theinstantaneousfluorescenceduringdarkrelaxation，Ft-Dn)和暗驰豫最大荧光(themaximumfluorescenceduringdarkrelaxation，Fm-Dn)。步骤(3)中，叶绿素荧光测量完成后，使用FluorCam7分析软件图像进行预处理。该软件可以实现对光源的选择和参数的调整，通过成像预处理可对测量后的绿豆叶片进行兴趣区域(ROI)的选区与荧光动力学曲线分析，并导出数据集。本专利技术利用SPSS22.0软件中的主成分分析对数据进行降维处理。识别算法分析采用MATLAB2019a完成，以PCA降维后数据为输入，模型的验证采用K折交叉验证(K-Foldcross-validation)，为兼顾试验模型的准确率与效率，本次试验将K值设为5。步骤(4)中，叶绿素荧光参数代表叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面，因此植物在遇到胁迫时，这些参数值将会发生变化，相应图像的荧光变化也能直观表现病害变化趋势。本专利技术分析了非光化荧光猝灭参数(qN)、光化学猝灭参数(qP与qL)和荧光衰减率(Rfd)随着接种天数的变化趋势及其对应荧光图像的变化。利用SPSS22.0以接种变灰尾孢菌时间为可控因素，以接种时间为自变量，以不同的叶绿素荧光参数指标作为观测变量进行单因素方差分析(ANOVA)与克鲁斯卡尔-沃利斯单因素秩方差分析(Kruskal-Wallis检验)。步骤(5)中，本专利技术的模型评价采用预测准确率和AUC值为指标。预测准确率是最直观的评价指标，同时AUC值也是评价模型整体预测效果的标准，AUC值在0-1间变动，当其越接近1时表示模型整体效果越好。兴趣区域(ROI)选择与数据的导出利用FluorCam7软件完成。本专利技术的关键创新点在于将叶绿素荧光成像技术用于绿豆叶斑病的早期检测技术中，并结合Cubic-SVM检测模型，以实现绿豆叶斑病的早期精准检测。叶绿素荧光成像技术具有可获取植物内部信息、受温湿度影响小、不局限于晴天采集、价格合理等优点。该技术与植物光合作用密不可分，其原理主要基于Butler等人在1978年提出的能量竞争模型，该模型认为植物通过光合作用得到的光能主要以热辐射、光合系统II的光化学反应以及释放光子产生叶绿素荧光三种方式被利用，叶绿素荧光成像技术就是对以上三种能量分配的研究分析。绿豆叶斑病病害的发展一般可分为侵入期、潜育期和发病期，早期病斑尚未显现，或微小病斑周围未见褪绿现象，人眼难以察觉，因而易被忽视，导致病害扩展。本专利技术以绿豆叶斑病高感品种‘V1197’作为供试样本进行样本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法，其特征在于包括如下步骤：/n(1)选取同等种植条件下的绿豆植株，设置试验组和对照组，试验组在复叶期进行致病菌菌丝块接种；对照组为未接菌绿豆植株；/n(2)采用叶绿素荧光成像系统获取试验组和对照组的叶绿素荧光数据；/n(3)采用主成分分析的方法对数据进行降维处理，以主成分分析降维后的数据作为输入进行模型训练；/n(4)构建绿豆叶斑病机器学习模型，采用Cubic-SVM算法模型对采集的叶绿素荧光数据进行训练及预测。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)选取同等种植条件下的绿豆植株，设置试验组和对照组，试验组在复叶期进行致病菌菌丝块接种；对照组为未接菌绿豆植株；
(2)采用叶绿素荧光成像系统获取试验组和对照组的叶绿素荧光数据；
(3)采用主成分分析的方法对数据进行降维处理，以主成分分析降维后的数据作为输入进行模型训练；
(4)构建绿豆叶斑病机器学习模型，采用Cubic-SVM算法模型对采集的叶绿素荧光数据进行训练及预测。


2.根据权利要求1所述的基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法，其特征在于：步骤(1)中，试验组接种包括在绿豆长出第一组复叶时，选择健康复叶进行变灰尾孢菌菌丝块的接种。


3.根据权利要求1所述的基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法，其特征在于：步骤(2)中，荧光成像前对植株进行暗处理，暗处理时间大于25分钟。


4.根据权利要求1所述的基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法，其特征在于：步骤(2)中，分别取试验组接种1天、2天...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴然然，陈新，李灵慧，袁星星，薛晨晨，陈景斌，闫强，林云，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32