缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了缺失型alpha‑地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针，包括分别针对HBA、CRE、HBZ基因的三组引物和探针，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.9的碱基序列。据此，发明专利技术人还研制了相应试剂和并建立相应基于Taqman探针的三重荧光PCR检测非常见缺失型alpha‑地中海贫血的方法。本发明专利技术具有灵敏度高、特异性强、结果可靠的特点，是一种理想的大规模探索广西常见和非常见的缺失型alpha‑地中海贫血基因的方法，从而弄清广西非常见的缺失型alpha‑地贫基因突变的基因谱和基因突变频率，为广西调整地贫防治策略、降低地贫患儿的出生提供科学依据。

【技术实现步骤摘要】
缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒
本专利技术属于地中海贫血检测
，尤其涉及缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒。
技术介绍
广西是我国地贫发病率和基因携带率最高的地区，最新调查显示，广西地贫的基因携带率是21％(alpha-地贫15.2％，belta-地贫5.8％)。地贫治疗困难，费用昂贵，对于大多数患者来说，倾其所有财富，却最多只能活到20岁，因此，地贫是广西亟待解决的重大民生问题。然而，当前广西地中海贫血的总发病率仍然高达0.2％，地中海贫血基因携带率仍然高达21％，说明目前使用的地中海贫血筛查方法存在不足，主要是：①不能检出静止型alpha-地中海贫血和轻型beta-地中海贫血；②只能检出常见型的地贫类型，不能检出非常见的地中海贫血。alpha-地贫的分子基础是位于16号染色体末端位点p13.3上的人alpha-珠蛋白基因(HBA2和HBA1)先天性遗传缺陷,从而使红细胞的主要结构蛋白(血红蛋白)生成障碍,并导致无效造血和红细胞破坏，而产生慢性溶血性贫血。alpha-地贫主要是由于alpha-珠蛋白基因缺失所致(90％以上),只有少数alpha-地贫是由于alpha-珠蛋白基因的点突变所致。据此将alpha-地贫分为两大类,即缺失型和非缺失型alpha-地贫。缺失型alpha-地贫的分子缺陷是包含alpha-珠蛋白基因在内的大片段基因缺失,其范围从几kb到100kb以上。非缺失型alpha-地贫突变的主要类型是发生在HBA2或HBA1结构基因或启动子区的点突变,导致加工异常、抑制转录或使翻译产物不稳定。正常人两条染色体上共有4个alpha-珠蛋白基因。不同类型的缺失型alpha-地贫患者,体内缺失的alpha-珠蛋白基因数目各不相同,缺失的alpha-珠蛋白基因越多,病情越严重。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针和试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针，包括分别针对HBA、CRE、HBZ基因的三组引物和探针，它们分别具有以下碱基序列：缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针，探针HBAPbR102、探针CREPb186R-Joe、探针HBZPbR9413-cy5的5’端分别标记有荧光报告基团FAM、JOE、CY5，其3’端分别标记有荧光淬灭基团BHQ1、BHQ1、BHQ3。缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量PCR反应液、DNA聚合酶、检测引物和检测探针；检测引物和检测探针是分别针对HBA、CRE、HBZ基因的三组引物和探针，它们分别具有以下碱基序列：探针HBAPbR102、探针CREPb186R-Joe、探针HBZPbR9413-cy5的5’端分别标记有荧光报告基团FAM、JOE、CY5，其3’端分别标记有荧光淬灭基团BHQ1、BHQ1、BHQ3。上述alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测试剂盒在PCR扩增反应中的应用。PCR扩增反应的体系为：反应体系总体积25μL，引物终浓度400nM，探针终浓度200nM；其中，主反应液(MasterMix)组成为：引物探针Mix(PMix)组成为：PCR扩增反应的程序为：95℃，5min；45个循环×(95℃，10s；60℃，45s)。针对非常见的地中海贫血缺乏有效检测手段的问题，专利技术人根据HBA、CRE、HBZ基因序列，设计并制备了缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针，包括分别针对HBA、CRE、HBZ基因的三组引物和探针，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.9的碱基序列。据此，专利技术人还研制了相应试剂和并建立相应基于Taqman探针的三重荧光PCR检测非常见缺失型alpha-地中海贫血的方法。试验结果显示，正常样本的判定值位于0.9-1.1之间，3个α基因拷贝的判定值位于0.65-0.85之间，2个α基因拷贝的判定值位于0.4-0.6之间，1个α基因拷贝的判定值位于0.15-0.35之间。表明设计的引物和探针特异性强、体系的优化效果也较佳，能辨别出不同α基因的拷贝数，具有灵敏度高、特异性强、结果可靠的特点，是一种理想的大规模探索广西常见和非常见的缺失型alpha-地中海贫血基因的方法，从而弄清广西非常见的缺失型alpha-地贫基因突变的基因谱和基因突变频率，为广西调整地贫防治策略、降低地贫患儿的出生提供科学依据。附图说明图1是应用本专利技术进行PCR扩增HBA、CRE和HBZ基因的结果图。具体实施方式一、研究设计该研究拟建立一个高通量高灵敏度的三重实时荧光定量PCR检测方法，能用于大规模探索非常见的缺失型alpha-地中海贫血基因，利用正常人和缺失型突变者alpha-珠蛋白基因(HBA2、HBA1)拷贝数不同，同步检测HBA2、HBA1和内参基因，根据2-△△Ct原理，相对定量HBA2、HBA1的基因拷贝数，从而检测HBA2、HBA1的基因缺失或基因叠加。由于HBA2和HBA1具有高度的同源性，作为一个初筛试验，同时测定HBA2和HBA1是不必要的。在本专利技术中，仅测定HBA2和HBA1的共同特征基因片段HBA，这种改变会减少多重PCR体系的复杂性。此外，先前一直有关于HBZ造成地贫缺失的报道，为了提高筛查试验检出非常见缺失型alpha-地贫基因突变的能力，加入了HBZ基因。这样不仅能检出常见的缺失类型，而且能检出非常见的缺失类型。研究通过设计HBA、HBZ和参比基因CREBP的引物和探针，建立三重TaqMan实时荧光定量PCR检测体系，为在广西全区大规模筛查缺失型alpha-地贫基因突变，进行流行病学调查提供有力工具。二、引物和探针的设计和合成通过NCBI上下载相关序列，通过BLAST功能保证引物序列的准确性，再用ABI的PrimerExpress3.0软件设计引物和TaqMan探针，委托深圳优圣康生物科技有限公司设计，所有引物探针均在Life公司合成，引物和探针序列见表1。表1荧光PCR引物和探针序列其中，探针HBA，CRE，HBZ的5’端分别标记有荧光报告基团FAM，JOE，CY5；HBA，CRE的3’端均标记有荧光淬灭基团BHQ1，HBZ的3’端标记有荧光淬灭基团BHQ3。三、三重实时荧光定量PCR检测方法1、操作步骤：1)对样本进行前处理：通过细胞分离液分离白细胞，尽可能去除红细胞或其碎片；2)提取DNA：采用分离液分离白细胞以后提取DNA，提取的DNA测定浓度后稀释至2ng/μL；3)使用针对HBA，C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针，其特征在于包括分别针对HBA、CRE、HBZ基因的三组引物和探针，它们分别具有以下碱基序列：/n

【技术特征摘要】
1.缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针，其特征在于包括分别针对HBA、CRE、HBZ基因的三组引物和探针，它们分别具有以下碱基序列：





2.根据权利要求1所述的缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测引物、探针，其特征在于：所述探针HBAPbR102、探针CREPb186R-Joe、探针HBZPbR9413-cy5的5’端分别标记有荧光报告基团FAM、JOE、CY5，其3’端分别标记有荧光淬灭基团BHQ1、BHQ1、BHQ3。


3.一种缺失型alpha-地中海贫血三重实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于包括实时荧光定量PCR反应液、DNA聚合酶、检测引物和检测探针；所述检测引物和检测探针是分别针对HBA、CRE、HBZ基因的三组引物和探针，它们分别具有以下碱基序列：





4.根据权利要求3所述的缺失型alpha-地中海贫血三重...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈发钦，王太重，吕姗，李佳，
申请(专利权)人：右江民族医学院，
类型：发明
国别省市：广西;45