本发明专利技术公开了干细胞移植技术领域的一种具有抗菌能力的肺脏干细胞及其应用。本发明专利技术提供一种具有抗菌能力的肺脏干细胞，含有表达抗菌肽hCAP18/LL‑37的重组载体。该肺脏干细胞，具有损伤修复和抗菌的功能，一方面能够修复损伤组织，另一方面能够预防和解决患者体内的微生物感染。本发明专利技术提供的肺脏干细胞可以在体内长期存留，抗菌的效果可以长期维持。本发明专利技术提供的具有抗菌能力的肺脏干细胞能够特异性分布在肺脏，实现在肺脏内的抗菌效果。
【技术实现步骤摘要】
一种具有抗菌能力的肺脏干细胞及其应用
本专利技术涉及干细胞移植
，具体涉及一种具有抗菌能力的肺脏干细胞及其应用。
技术介绍
人的体表以及与外界相通的腔道存在大量的正常菌群，它们在人体免疫功能正常的情况下，对人体有益无害；但当机体抵抗力减弱，或由于各种原因引起防御免疫功能降低时，原来正常的寄居菌或外源性的细菌可能侵入人体，造成人体局部或全身性炎症反应，随之而来也会对机体内部分组织和细胞带来破坏性的伤害。对于患有组织损伤性病变的患者，细菌、真菌等微生物感染往往与组织损伤并存，一方面容易引起各种并发症，另一方面也会不断加重组织损伤，对实体脏器进行实质性损伤，严重危害患者的生命健康，组织损伤和细菌感染会形成一个恶性循环。对于组织损伤性病变，本领域技术人员利用干细胞的无限自我更新和分化成多种类型细胞的能力，采取干细胞移植进行损伤组织的修复。干细胞移植，主要从成体中分离出干细胞，并在体外进行培养和扩增，再制备成临床级的细胞制剂后，移植到患者的体内对损伤组织进行修复，治疗相关的疾病。干细胞移植进行损伤组织修复，一方面，移植到体内的干细胞可以在损伤处进行组织再生，修复损伤结构；另一方面，干细胞通过旁分泌/自分泌途径产生的趋化因子和生长因子等众多生物活性分子可以改善移植部位的微环境。但是，干细胞并不能对细菌的感染起到直接的抑制作用，这减弱了干细胞对于细菌感染患者的治疗作用。目前，人类应用抗生素和合成类抗菌药物治疗细菌感染性疾病，但是临床中抗生素及合成类抗菌药物的非理性使用而产生的耐药性和抗药性成为一个不可忽视的事实。为此，寻找一种同时具有抗菌能力和组织修复能力的干细胞很有必要。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于提供一种具有抗菌能力的肺脏干细胞及其应用。Cathelicidins是一种古老而又庞大的抗菌肽家族，是哺乳动物防御系统的主要成员。人类阳离子抗菌蛋白18(humancationicantimicrobialprotein18，hCAP18)是迄今在人体中发现的cathelicidins家族的唯一成员。LL-37是hCAP18被蛋白酶水解后释放的有37个氨基酸的C端，因其N末端前两个氨基酸残基为亮氨酸(L)和氨基酸残基总数为37而得名，有的文献称之为LL-37/hCAP18。随着对LL-37研究的逐渐深入，发现LL-37作为一个固有免疫系统的重要组成成分，具有抗细菌、真菌，降解生物膜，抗病毒等多种抗微生物作用，除此之外LL-37还具有调节炎症反应，趋化免疫细胞，协调固有/获得性免疫系统，促进损伤修复等多种作用。LL-37具有广泛的抗革兰氏阳性和阴性菌的能力。许多研究表明，LL-37可以通过直接杀菌作用杀死铜绿假单胞菌、淋病奈瑟菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌等。本专利技术提供一种具有抗菌能力的肺脏干细胞，含有表达抗菌肽hCAP18/LL-37的重组载体。进一步地，所述重组载体为病毒载体。进一步地，所述抗菌肽hCAP18的表达框架为：5’到3’方向依次为启动子、抗菌肽hCAP18的编码基因；所述抗菌肽LL-37的表达框架为：5’到3’方向依次为启动子、信号肽的编码基因、抗菌肽LL-37的编码基因。进一步地，所述hCAP18的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；LL-37的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述hCAP18的编码基因如SEQIDNO.3所示；LL-37的编码基因如SEQIDNO.4所示；所述信号肽的编码基因如SEQIDNO.5所示。进一步地，所述启动子为EF1a。本专利技术还提供具有抗菌能力的肺脏干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：肺脏干细胞的获取：取离体肺脏组织进行消化处理，终止消化后收集细胞；取部分经消化处理后的细胞，利用铺被滋养层细胞的培养板对细胞进行铺板培养，收集细胞并利用铺被滋养层细胞的培养板对其进行扩增培养，待细胞长满至培养板表面积的85％-95％时，消化并收集贴壁细胞，即得；重组载体的构建：构建表达抗菌肽hCAP18/LL-37的重组载体，并包装成为病毒颗粒；肺脏干细胞的感染：用上述病毒颗粒感染上述肺脏干细胞，同时加入聚凝胺，培养24/48h，即得。进一步地，铺板培养包括以下步骤：取待进行铺板培养的细胞，用肺脏干细胞培养基重悬并铺于铺被滋养层细胞的培养板中；培养板中加入抗生素；在37℃，CO2浓度为4％-8％条件下培养，隔天更换培养基，待细胞呈克隆状生长至细胞聚集成团，细胞克隆长大至超过80％的克隆中有40-100个细胞，收集细胞。进一步地，所述组织消化液包含99v％的DMEM/F12、1-20ng/mL的DNA酶、0.1-4mg/mL蛋白酶和10-200ng/mL胰酶；所述消化处理的温度为37℃，时间为0.5-2h。进一步地，肺脏干细胞培养基的配方为：225mLDMEM、225mLF12、20-70mLFBS、0.2-2mML-谷氨酰胺、1-14ng/mL胰岛素、0.1-1ng/mL表皮生长因子、5-30ug/mL腺嘌呤、2-20ug/mL氢化可的松。本专利技术还提供具有抗菌能力的肺脏干细胞在制备治疗肺脏组织损伤性病变药物中的应用。本专利技术进一步提供一种治疗肺脏组织损伤性病变的药物，其主要活性成分为上述具有抗菌能力的肺脏干细胞。本专利技术技术方案，具有如下优点：1、本专利技术提供的具有抗菌能力的肺脏干细胞，具有损伤修复和抗菌的功能，一方面能够修复损伤组织，另一方面能够预防和解决患者体内的微生物感染。此外，肺脏干细胞可以在体内长期存留，抗菌的效果可以长期维持；肺脏干细胞能够特异性分布在肺脏，实现在肺脏内的抗菌效果。2、本专利技术通过表达hCAP18基因来产生抗菌肽LL-37，与生理过程一致，LL-37的产生量受外界环境需求的调控，当出现大量感染时，可以诱导大量hCAP18基因的表达和剪切从而产生大量的LL-37分泌到细胞外发生抗菌的作用；当感染解除，不需LL-37进行抗菌时，hCAP18表达并剪切形成LL-37的过程会受到抑制，产生的LL-37减少，从而避免LL-37带来的副反应。附图说明为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本专利技术实验例1hCAP18-mDASC中抗菌肽LL-37的qPCR定量结果；图2是本专利技术实验例1hCAP18-mDASC中抗菌肽LL-37的蛋白免疫印迹实验结果；图3是本专利技术实验例1hCAP18-mDASC中抗菌肽LL-37的免疫荧光染色结果，其中，A为hCAP18-mDASC和WT-mDASC干细胞标志物的检测；B为抗菌肽LL-37在hCAP18-mDASC和WT-mDASC细胞中的表达；图4是本专利技术实验例1hCAP18-mDASC的杀菌能力评本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种具有抗菌能力的肺脏干细胞，含有表达抗菌肽hCAP18/LL-37的重组载体。/n
【技术特征摘要】
1.一种具有抗菌能力的肺脏干细胞，含有表达抗菌肽hCAP18/LL-37的重组载体。
2.根据权利要求1所述的具有抗菌能力的肺脏干细胞，其特征在于，所述重组载体为病毒载体。
3.根据权利要求1所述的具有抗菌能力的肺脏干细胞，其特征在于，所述抗菌肽hCAP18的表达框架为：5’到3’方向依次为启动子、抗菌肽hCAP18的编码基因；所述抗菌肽LL-37的表达框架为：5’到3’方向依次为启动子、信号肽的编码基因、抗菌肽LL-37的编码基因。
4.根据权利要求3所述的具有抗菌能力的肺脏干细胞，其特征在于，所述hCAP18的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；LL-37的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；所述hCAP18的编码基因如SEQIDNO.3所示；LL-37的编码基因如SEQIDNO.4所示；所述信号肽的编码基因如SEQIDNO.5所示。
5.根据权利要求3所述的具有抗菌能力的肺脏干细胞，其特征在于，所述启动子为EF1a。
6.权利要求1-5任一项所述的具有抗菌能力的肺脏干细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
肺脏干细胞的获取：取离体肺脏组织进行消化处理，终止消化后收集细胞；取部分经消化处理后的细胞，利用铺被滋养层细胞的培养板对细胞进行铺板培养，收集细胞并利用铺被滋养层细胞的培养板对其进行扩增培养，待细胞长满至培养板表面积的85％-95％时，消化并收集贴壁细胞，即得；
重组载体的构建：构建表...
【专利技术属性】
技术研发人员：左为，张婷，马煜，周悦青，
申请(专利权)人：同济大学，江西省仙荷医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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