通过功能结构域嫁接提高聚合酶大片段活性的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种通过功能结构域嫁接提高聚合酶大片段活性的方法：将Sso7d DNA结合蛋白的基因(如SEQ ID NO.1所示)与野生型Bst DNA聚合酶大片段的基因连接(如SEQ ID NO.2所示)，得到的基因序列如SEQ ID NO.5所示，并转入原核表达载体进行表达、纯化，得到了重组的Bst DNA聚合酶大片段：Sso7d‑Bst DNA聚合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。通过反应速率检测结果显示：Sso7d‑Bst DNA聚合酶大片段较野生型的Bst DNA聚合酶大片段反应速率提高。

【技术实现步骤摘要】
通过功能结构域嫁接提高聚合酶大片段活性的方法及应用
本专利技术涉及一种通过功能结构域嫁接的方法提高嗜热脂肪土芽孢杆菌属(Geobacillusstearothermophilus)DNA聚合酶大片段即BstDNA聚合酶大片段对底物亲和力的方法及应用，属于分子生物学、蛋白质工程、酶工程领域。
技术介绍
DNA聚合酶，又称DNA依赖的DNA聚合酶(DNAdependentDNApolymerase)，它是以亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶，广泛存在于原核生物和真核生物中，是基因复制的基础，是维持机体基因组稳定和完整遗传的关键。DNA聚合酶有三种功能：①聚合作用：在引物3'-OH末端，以dNTP为底物，按模板DNA上的指令，即A与T，C与G的配对原则，逐步逐个、连续地将dNTP加到延伸中的DNA分子3'-OH末端，逐步合成延长中的子链DNA。这是DNA聚合酶的主要作用；②3’→5’外切酶活性(校对作用)：从3’→5’方向识别和切除不配对的子链DNA末端的核苷酸，主要功能是校对作用，保证复制过程的保真性和准确性；③5’→3’外切酶活性(切除修复作用)：从5’→3’方向水解DNA延长链前方的DNA链(即只对DNA上双链处的磷酸二酯键有切割作用)，产生5'—脱氧核苷酸。这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。嗜热脂肪土芽孢杆菌属(Geobacillusstearothermophilus)DNA聚合酶，即BstDNA聚合酶，基因全长2631bp，氨基酸序列全长876aa，BstDNA聚合酶大片段是BstDNA聚合酶第291位氨基酸至876位氨基酸序列酶，其不具有BstDNA聚合酶5’→3’外切酶活性(切除修复作用)，无水解母链DNA分子5’端的单核苷酸，因其继承了5’端的单核苷酸的链置换反应、高保真、耐高温等特点，而成为一种重要的商用DNA多重置换扩增酶。Sso7d是一种来源于嗜热硫化裂片菌(Sulfolobussolfataricus)的双链DNA结合蛋白，分子量为7kd，可非特异性的结合双链DNA片段，结合后会产生不可预料的效果(或降低活性，或提高活性，或灭活，或无变化)。本专利技术尝试将Sso7d、Sso7a、Sso7c3、Sso7c4系列双链DNA结合蛋白的DNA结合结构域与BstDNA聚合酶大片段融合，旨在提高BstDNA聚合酶大片段的反应速率。单链结合蛋白(SingleStrandBindingprotein，SSB)又称DNA结合蛋白，其功能在于非特异性的和单链DNA结合，稳定解开的DNA单链，阻止复性和保护单链部分不被核酸酶水解，主要参与DNA复制、修复和重组。单链结合蛋白是177个氨基酸组成的蛋白，发挥功能是以四聚体的形式与单链DNA结合，并和其他单链结合蛋白四聚体、相邻单链DNA结合，被结合的单链DNA是呈伸展状态的，这种功能有利于以单链DNA作为模板进行的核酸扩增。因此，将单链结合蛋白与BstDNA聚合酶大片段共价连接或许可以提高DNA聚合酶对底物的亲和力，以提高反应速率。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种通过功能结构域嫁接提高聚合酶大片段活性的方法，本专利技术分别将Sso7dDNA结合蛋白、SSB单链结合蛋白与嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)BstDNA聚合酶大片段通过共价键连接，得到了两种重组的BstDNA聚合酶大片段：Sso7d-BstDNA聚合酶，SSB-BstDNA聚合酶；通过反应速率检测结果显示：Sso7d-BstDNA聚合酶大片段较野生型的BstDNA聚合酶大片段反应速率提高，而SSB-BstDNA聚合酶大片段较野生型的BstDNA聚合酶大片段反应速率降低。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种通过功能结构域嫁接提高聚合酶大片段活性的方法：将Sso7dDNA结合蛋白的基因与野生型BstDNA聚合酶大片段的基因连接，并转入原核表达载体进行表达、纯化；所述Sso7dDNA结合蛋白的基因序列如下所示，如SEQIDNO.1所示；所述野生型BstDNA聚合酶大片段的基因序列如下所示，如SEQIDNO.2所示。Sso7dDNA结合蛋白的基因序列(5’→3’)(SEQIDNO.1)：CATATGATGGCAACCGTAAAGTTCAAGTACAAAGGCGAAGAAAAAGAGGTAGACATCTCCAAGATCAAGAAAGTATGGCGTGTGGGCAAGATGATCTCCTTCACCTACGACGAGGGCGGTGGCAAGACCGGCCGTGGTGCGGTAAGCGAAAAGGACGCGCCGAAGGAGCTGCTGCAGATGCTGGAGAAGCAGAAAAAG。野生型BstDNA聚合酶大片段的基因序列：(5’→3’)(SEQIDNO.2)：CATATGGAAGGGGAGAAACCGCTTGAGGAGATGGAGTTTGCCATCGTTGACGTCATTACCGAAGAGATGCTTGCCGACAAGGCAGCGCTTGTCGTTGAGGTGATGGAAGAAAACTACCACGATGCCCCGATTGTCGGAATCGCACTAGTGAACGAGCATGGGCGATTTTTTATGCGCCCGGAGACCGCGCTGGCTGATTCGCAATTTTTAGCATGGCTTGCCGATGAAACGAAGAAAAAAAGCATGTTTGACGCCAAGCGGGCAGTCGTTGCCTTAAAGTGGAAAGGAATTGAGCTTCGCGGCGTCGCCTTTGATTTATTGCTCGCTGCCTATTTGCTCAATCCGGCTCAAGATGCCGGCGATATCGCTGCGGTGGCGAAAATGAAACAATATGAAGCGGTGCGGTCGGATGAAGCGGTCTATGGCAAAGGCGTCAAGCGGTCGCTGCCGGACGAACAGACGCTTGCTGAGCATCTCGTTCGCAAAGCGGCAGCCATTTGGGCGCTTGAGCAGCCGTTTATGGACGATTTGCGGAACAACGAACAAGATCAATTATTAACGAAGCTTGAGCAGCCGCTGGCGGCGATTTTGGCTGAAATGGAATTCACTGGGGTGAACGTGGATACAAAGCGGCTTGAACAGATGGGTTCGGAGCTCGCCGAACAACTGCGTGCCATCGAGCAGCGCATTTACGAGCTAGCCGGCCAAGAGTTCAACATTAACTCACCAAAACAGCTCGGAGTCATTTTATTTGAAAAGCTGCAGCTACCGGTGCTGAAGAAGACGAAAACAGGCTATTCGACTTCGGCTGATGTGCTTGAGAAGCTTGCGCCGCATCATGAAATCGTCGAAAACATTTTGCATTACCGCCAGCTTGGCAAACTGCAATCAACGTATATTGAAGGATTGTTGAAAGTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过功能结构域嫁接提高聚合酶大片段活性的方法，其特征在于：将Sso7d DNA结合蛋白的基因与野生型Bst DNA聚合酶大片段的基因连接，并转入原核表达载体进行表达、纯化；/n所述Sso7d DNA结合蛋白的基因序列如下所示，如SEQ ID NO.1所示；/n所述野生型Bst DNA聚合酶大片段的基因序列如下所示，如SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种通过功能结构域嫁接提高聚合酶大片段活性的方法，其特征在于：将Sso7dDNA结合蛋白的基因与野生型BstDNA聚合酶大片段的基因连接，并转入原核表达载体进行表达、纯化；
所述Sso7dDNA结合蛋白的基因序列如下所示，如SEQIDNO.1所示；
所述野生型BstDNA聚合酶大片段的基因序列如下所示，如SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述的通过功能结构域嫁接提高聚合酶大片段活性的方法，其特征在于：通过Linker将Sso7dDNA结合蛋白的基因与野生型BstDNA聚合酶大片段的基因连接。


3.根据权利要求2所述的通过功能结构域嫁接提高聚合酶大片段活性的方法，其特征在于：所述Linker序列如SEQIDNO.3所示。
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【专利技术属性】
技术研发人员：任黎明，陈臻，段海峰，
申请(专利权)人：赛纳生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11