核酸测序中的增加的信噪比制造技术

一种用于通过以下步骤鉴定模板核酸中的核苷酸的方法：(a)提供多种引物‑模板核酸杂交体，其中所述引物具有可延伸的3’末端；(b)使所述多种引物‑模板核酸杂交体与以下物质接触：(i)封闭的核苷酸，以产生第一亚组的在3’末端包含封闭的核苷酸的引物‑模板核酸杂交体，和(ii)三元复合物抑制剂，以产生第二亚组的包含三元复合物抑制剂的引物‑模板核酸杂交体；(c)形成三元复合物，所述三元复合物各自包括聚合酶、所述第一亚组的引物‑模板核酸杂交体和同源核苷酸；以及(d)检测所述三元复合物，从而鉴定所述模板核酸中的核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸测序中的增加的信噪比
技术介绍
本公开总体上涉及核酸的表征，并且对核酸测序具有特定的适用性。使用核酸系综(ensemble)进行了几种商业核酸测序技术。通常通过扩增技术产生所述系综，所述扩增技术产生作为整体被操作和检测的核酸拷贝的局部集合。用于创建系综的示例性技术包括Illumina平台(SanDiego,CA)使用的桥式扩增技术、IonTorrent平台(ThermoFisher,WalthamMA)使用的乳液聚合酶链式反应技术和CompleteGenomics平台(BGI,ShenzhenChina)使用的滚环技术。与单分子测序技术相比，系综提供了更高信号幅度的益处，并最大限度地减少了操纵和检测单分子时随机噪声产生的假象(artifact)。尽管广泛采用了基于系综的测序技术，但所谓的“定相(phasing)”限制了读取长度、总体通量和准确度。定相是系综内各个分子彼此失去同步的现象。定相可以表现为一个或多个引物分子的延伸落在系综中另外的引物分子的延伸后面，或者表现为一个或多个引物分子的延伸走在系综中另外的引物分子的延伸前面。定相是有害的并且是累积的。每个循环仅为0.5％的定相率导致120个循环后累积损失约一半的真实信号。该问题因背景噪声成比例增加而加剧，所述背景噪声是由异相的系综成员产生的虚假信号造成的。因为噪声会淹没信号，信噪比的累积损失导致对读取长度的限制(这进而导致测序通量减少)和误差增加(尤其是对于后面的循环)。因此，需要减少或防止基于系综的测序中的定相的方法。本专利技术满足了这种需要并且还提供了其它有利方面。
技术实现思路
本公开提供了用于鉴定模板核酸中的核苷酸的方法。所述方法可包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板核酸杂交体，其中所述引物具有可延伸的3’末端；(b)使所述多种引物与以下物质接触：(i)封闭的核苷酸，以产生第一亚组的在3’末端包含封闭的核苷酸的引物-模板核酸杂交体，和(ii)三元复合物抑制剂，以产生第二亚组的包含三元复合物抑制剂的引物-模板核酸杂交体；(c)形成三元复合物，所述三元复合物各自包括聚合酶、第一亚组的引物-模板核酸杂交体和同源核苷酸；以及(d)检测三元复合物，从而鉴定模板核酸中的核苷酸。任选地，封闭的核苷酸可以是可逆终止的核苷酸。还提供了用于鉴定模板核酸中的核苷酸的方法，其包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板核酸杂交体，其中所述引物具有可延伸的3’末端；(b)在第一亚组的引物-模板核酸杂交体的一种或多种引物的3’末端掺入封闭的核苷酸；(c)在第二个亚组的引物-模板核酸杂交体的一种或多种引物的3’末端掺入三元复合物抑制剂；(d)形成三元复合物，所述三元复合物各自包括聚合酶、第一亚组的引物-模板核酸杂交体和同源核苷酸；以及(e)检测三元复合物，从而鉴定模板核酸中的核苷酸。任选地，封闭的核苷酸可以是可逆终止的核苷酸。本公开提供用于对模板核酸进行测序的方法。所述方法可包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板核酸杂交体，其中所述引物具有可延伸的3’末端；(b)使所述多种引物与以下物质接触：(i)可逆终止的核苷酸，以产生第一亚组的在3’末端处包含可逆终止的核苷酸的引物-模板核酸杂交体，和(ii)三元复合物抑制剂，以产生第二亚组的包含三元复合物抑制剂的引物-模板核酸杂交体；(c)形成三元复合物，所述三元复合物各自包括聚合酶、第一亚组的引物-模板核酸杂交体和同源核苷酸；(d)检测三元复合物，从而鉴定模板核酸中的核苷酸；(e)使第一亚组中的引物-模板核酸杂交体3’末端处的可逆终止的核苷酸解封闭；以及(f)重复步骤(b)至(e)以对第一亚组中的模板核酸进行测序。用于对模板核酸测序的方法可包括以下步骤：(a)提供多种引物-模板核酸杂交体，其中所述引物具有可延伸的3’末端；(b)在第一亚组的引物-模板核酸杂交体的一种或多种引物的3’末端掺入封闭的核苷酸；(c)在第二亚组的引物-模板核酸杂交体的一种或多种引物的3’末端掺入三元复合物抑制剂；(d)形成三元复合物，所述三元复合物各自包括聚合酶、第一亚组的引物-模板核酸杂交体和同源核苷酸；(e)检测三元复合物，从而鉴定模板核酸中的核苷酸；(f)使第一亚组中引物-模板核酸杂交体的3’末端的可逆终止的核苷酸解封闭；以及(g)重复步骤(b)至(f)以对第一亚组中的模板核酸进行测序。本公开还提供了包括多种引物-模板核酸杂交体的装置，其中第一亚组的引物-模板核酸杂交体在引物的3’末端具有封闭的核苷酸，并且其中第二亚组的引物-模板核酸杂交体在引物的3’末端具有三元复合物抑制剂。任选地，封闭的核苷酸可以是可逆终止的核苷酸。具体实施方式本公开提供了用于鉴定存在于引物-模板核酸杂交体中的询问位置(interrogationposition)的核苷酸碱基的方法。被询问的位置是紧接模板中与引物3’端末杂交的碱基的5’的碱基。可在用于检测在引物-模板核酸杂交体、聚合酶和询问位置处的碱基的核苷酸同源物之间形成的三元复合物的检查步骤中鉴定存在于探询位置的核苷酸。聚合酶的功能是将同源核苷酸与模板的下一个碱基配对。通过区分三元复合物中存在的核苷酸的类型，并根据WatsonCrick碱基配对推断与之杂交的模板碱基，可以确定询问位置处碱基的身份。在特定的实施方案中，引物可以递增地延伸，以便沿着模板移动询问位置。例如，可通过一系列其中使引物延伸单个核苷酸以移至下一个要询问的模板位置并在新的询问位置进行检查的循环来确定模板的序列。不完全的延伸可导致测序错误或测序过程提前终止。例如，当将引物-模板核酸杂交体群体作为一个系综进行测序时，也会出现定相问题。本公开提供了可用于例如在测序方法中改进核酸中碱基的鉴定的方法和组合物。可通过包括引物修饰方法来实现改进，所述引物修饰方法将不会随后被检测的引物加帽(cap)。例如，可以对引物延伸步骤中未延伸的引物进行加帽，使得未延伸的引物不会在后续检查步骤中导致错误。对于其中通过检查三元复合物鉴定模板核苷酸的实施方案，通过三元复合物抑制剂提供特别有用的加帽。三元复合物抑制剂可以是当与引物连接时阻止聚合酶和/或同源核苷酸参与在经修饰的引物末端处形成或维持三元复合物的部分。三元复合物抑制剂可存在于引物的末端，例如，作为对一种或多种组分产生空间阻断(否则所述组分会形成三元复合物)的部分，或者作为产生排斥一种或多种组分的电荷的部分。举例来说，当引物完全延伸使得没有模板位置可用于形成三元复合物时，可导致三元复合物形成的抑制。完全延伸可表现为延伸的引物的3’末端与模板的5’末端退火。在这种构型中，双链延伸产物不含未配对的下一个模板碱基。在替代构型中，完全延伸可表现为引物被延伸，直至进一步延伸被延伸产物环境中的因素阻止。在这种构型中，模板可含有未配对的下一个模板碱基，但由于模板和延伸引物周围的环境，聚合酶无法接近下一个模板碱基(和/或无法接近下一个正确的核苷酸)。例如，可使模板的5’末端这样附接至固相表面，并且延伸引物的3’末端如此接近表面，以致不仅阻止聚合酶进一步延伸，而且还阻止其结合以形成三元复合物。在这两个实例中，完全延伸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定模板核酸中核苷酸的方法，所述方法包括/n(a)提供多种引物-模板核酸杂交体，其中所述引物包含可延伸的3’末端；/n(b)使所述多种引物-模板核酸杂交体与以下物质接触：/n(i)封闭的核苷酸，以产生第一亚组的各自在3’末端包含封闭的核苷酸的引物-模板核酸杂交体，和/n(ii)三元复合物抑制剂，以产生第二亚组的各自包含三元复合物抑制剂的引物-模板核酸杂交体；/n(c)形成三元复合物，所述三元复合物各自包括聚合酶、所述第一亚组的引物-模板核酸杂交体和同源核苷酸；以及/n(d)检测所述三元复合物，从而鉴定所述模板核酸中的核苷酸。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180531 US 62/678,4341.一种鉴定模板核酸中核苷酸的方法，所述方法包括
(a)提供多种引物-模板核酸杂交体，其中所述引物包含可延伸的3’末端；
(b)使所述多种引物-模板核酸杂交体与以下物质接触：
(i)封闭的核苷酸，以产生第一亚组的各自在3’末端包含封闭的核苷酸的引物-模板核酸杂交体，和
(ii)三元复合物抑制剂，以产生第二亚组的各自包含三元复合物抑制剂的引物-模板核酸杂交体；
(c)形成三元复合物，所述三元复合物各自包括聚合酶、所述第一亚组的引物-模板核酸杂交体和同源核苷酸；以及
(d)检测所述三元复合物，从而鉴定所述模板核酸中的核苷酸。


2.如权利要求1所述的方法，其中所述封闭的核苷酸包括可逆终止的核苷酸，并且其中所述第一亚组的引物-模板核酸杂交体各自在3’末端处包含可逆终止的核苷酸


3.如权利要求2所述的方法，所述方法还包括
(e)对所述第一亚组中的所述引物-模板核酸杂交体的3’末端的所述可逆终止的核苷酸解封闭。


4.如权利要求3所述的方法，所述方法还包括
(f)重复步骤(b)至(e)以对所述第一亚组中的模板核酸进行测序。


5.如权利要求4所述的方法，所述方法还包括在步骤(f)之前从所述第一亚组的引物-模板核酸杂交体中去除所述聚合酶和同源核苷酸。


6.如权利要求4或5所述的方法，其中只要所述第一亚组中的所述引物-模板核酸杂交体的数目大于所述多种引物-模板核酸杂交体的50％，就重复步骤(b)至(f)。


7.如权利要求4或5所述的方法，其中只要所述第二亚组中的所述引物-模板核酸杂交体的数目少于所述多种引物-模板核酸杂交体的50％，就重复步骤(b)至(f)。


8.如权利要求4至7中任一项所述的方法，其中重复步骤(b)至(f)至少100次。


9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第二亚组的引物-模板核酸杂交体基本上由一种引物-模板核酸杂交体组成。


10.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第二亚组的引物-模板核酸杂交体包含至少两种引物-模板核酸杂交体。


11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第二亚组的引物-模板核酸杂交体包含少于1％的所述多种引物-模板核酸杂交体。


12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述多种引物-模板核酸杂交体附接至固体载体。


13.如权利要求12所述的方法，其中所述多种引物-模板核酸杂交体附接至阵列的特征。


14.如权利要求13所述的方法，其中附接至所述特征的所述多种引物-模板核酸杂交体包含至少100个具有共同序列的拷贝。


15.如权利要求13或14所述的方法，其中附接至所述特征的所述引物-模板核酸杂交体被检测为系综。


16.如权利要求12所述的方法，其中所述多种引物-模板核酸杂交体包含附接至阵列的不同特征的不同模板。


17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述三元复合物抑制剂包含寡核苷酸部分。


18.如权利要求17所述的方法，其中所述寡核苷酸部分通过在步骤(b)中使寡核苷酸与所述引物-模板核酸杂交体连接而产生。


19.如权利要求18所述的方法，其中所述寡核苷酸部分通过步骤(b)中所述引物-模板核酸杂交体的聚合酶催化延伸而产生。


20.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述三元复合物抑制剂包含抑制聚合酶在所述引物的3’末端结合的部分。


21.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述三元复合物抑制剂包含抑制同源核苷酸在所述引物的3’末端与聚合酶结合的部分。


22.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述三元复合物抑制剂在所述引物的3’末端包含错配核苷酸。


23.如权利要求1至22中任一项所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：查德·弗莱舍，丹尼斯·马利舍夫，
申请(专利权)人：欧姆尼欧美公司，
类型：发明
国别省市：美国;US