一种融合蛋白及其在降解聚合物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种融合蛋白及其在降解聚合物中的应用，属于生物技术领域。本发明专利技术提供了一种降解效果好的可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯等聚合物的融合蛋白，此融合蛋白由角质酶、连接肽和碳水化合物结合组件依次相连而得，使用此融合蛋白降解PET膜，降解4d，即可使PET降解产物中苯二甲酸(TPA)的含量高达116.83mg/L，而使用等酶活的未融合角质酶在同等条件下降解PET膜，降解产物中未检测到苯二甲酸(TPA)，并且，使用此融合蛋白降解聚丙烯酸酯的降解率较未融合角质酶提高了36％。

【技术实现步骤摘要】
一种融合蛋白及其在降解聚合物中的应用
本专利技术涉及一种融合蛋白及其在降解聚合物中的应用，属于生物

技术介绍
随着经济的高速发展，人们对塑料制品的消耗水平显著提高，全球每年的塑料消耗量超3.2亿吨，并且，此塑料消耗量每年以4～6％的速度增长。但是，由于塑料难以降解，因此，全球每年的塑料制品回收利用率仅有14％，这使得塑料垃圾在环境中持续积累，对生态构成了严重的威胁。聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)是乙二醇(Ethyleneglycol,EG)和对苯二甲酸(Terephthalicacid,TPA)以酯键依次连接形成的线性大分子。目前，聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)塑料制品约占所有塑料制品的60％，相应的，PET塑料垃圾在所有塑料垃圾中也占比较高。因此，降解PET对治理塑料垃圾十分关键。目前，人们依旧停留在使用传统的如酸解、碱解或醇解等的化学降解法或如热解等的物理降解法降解PET的阶段。但是，化学降解法需要使用大量的化学品，物理降解法则需要高温和高压的设备，这大大增加了PET的治理成本。并且，利用化学降解法降解PET的过程中会产生大量有毒有害物质，这些有毒有害物质会对生态环境产生较为严重的负面影响，使得PET的降解得不偿失。因此，世界各国仍在积极探索降解PET的新技术。生物酶降解技术是直接通过可降解塑料的生物酶降解塑料的技术，由于其具有绿色无污染以及成本低的优势，逐渐成为塑料降解领域的研究热点。角质酶既可以催化水解不溶性多聚体植物角质的酯键，也可以降解一些长链、短链脂肪酸酯、可溶性的合成酯和乳化的甘油三酯等，是一种多功能裂解酶。角质酶可作用于PET、聚氨酯等聚酯分子上的酯键，造成酯键断裂。然而，相比于C-O键连接的聚羟基脂肪酸酯(PHA)和聚乳酸(PLA)等生物基塑料，PET分子链中含有大量芳香基团，这导致PET分子链空间位阻大且表面更加疏水，难以被生物酶解，尤其在室温或者较低温度下。例如，M.Ronkvist等人用来源于Pseudomonasmendocina的角质酶降解PET96h，可使PET的降解率仅有5％(具体可见参考文献：RonkvistM,XieW,LuW,etal.Cutinase-CatalyzedHydrolysisofPoly(ethyleneterephthalate).Macromolecules,2009,42(14):5128-5138)。因此，现有的利用生物酶降解技术降解PET的效果有待提高。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种降解效果好的可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)等聚合物的酶。[技术方案]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含角质酶、连接肽和碳水化合物结合组件(carbohydrate-bindingmodule,CBM)。在本专利技术的一种实施方式中，所述融合蛋白由角质酶、连接肽和碳水化合物结合组件依次相连而得。在本专利技术的一种实施方式中，所述角质酶的氨基酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2SEQIDNO.3、SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO.6、SEQIDNO.7SEQIDNO.8或SEQIDNO.9所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述碳水化合物结合组件的氨基酸序列如SEQIDNO.10、SEQIDNO.11、SEQIDNO.12或SEQIDNO.13所示。本专利技术还提供了一种基因，所述基因编码上述融合蛋白。本专利技术还提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带上述基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒的表达载体为pET-5a(+)质粒、pET-11b(+)质粒、pET-14b(+)质粒、pHY300PLK质粒、pET-20b(+)质粒、pET-21b(+)质粒、pET-24a(+)质粒、pET-28a(+)质粒、pET-30c(+)质粒、pET-32b(+)质粒、pET-34b(+)质粒、pET-40b(+)质粒、pET-41b(+)质粒、pET-42c(+)质粒、pET-49b(+)质粒、pET-50b(+)质粒或pRSFDuet-1质粒。本专利技术还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带上述基因或上述重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌(Escherichiacoli)或枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。本专利技术还提供了一种降解聚合物的方法，所述方法为将上述融合蛋白添加至含有聚合物的降解体系中进行降解。在本专利技术的一种实施方式中，所述聚合物为聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚丙烯酸酯。在本专利技术的一种实施方式中，所述降解的温度为20～70℃、pH为5.0～9.0、转速为100～200rpm。本专利技术还提供了上述融合蛋白或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述方法在降解聚合物中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述聚合物为聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚丙烯酸酯。[有益效果]本专利技术提供了一种降解效果好的可降解聚对苯二甲酸乙二醇酯等聚合物的融合蛋白，此融合蛋白由角质酶、连接肽和碳水化合物结合组件依次相连而得，使用此融合蛋白降解PET膜，降解4d，即可使PET降解产物中苯二甲酸(TPA)的含量高达116.83mg/L，而使用等酶活的未融合角质酶在同等条件下降解PET膜，降解产物中未检测到苯二甲酸(TPA)，并且，使用此融合蛋白降解聚丙烯酸酯的降解率较未融合角质酶提高了36％。附图说明图1：苯二甲酸(TPA)标准品的液相图。图2：融合蛋白降解PET膜所得降解产物的液相图。具体实施方式下述实施例中涉及的pET-24a(+)质粒、pET-20b(+)质粒、pET-32b(+)质粒、pET-14b(+)质粒、pET-40b(+)质粒购自TaKaRa(大连)生物工程有限公司；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21购自优宝生物；下述实施例中涉及的PET膜购自Goodfellow公司；下述实施例中涉及的苯二甲酸(TPA)标准品购自sigma公司。下述实施例中涉及的试剂和培养基如下：LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L。LB固体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、琼脂20g/L。TB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉24g/L、甘油5g/L、K2HPO4·3H2O16.43g/L、KH2PO42.31g/L。下述实施例中涉及的检测方法如下：角质酶酶活的测定：采用连续分光光度法。反应体系为1.5mL，包括30μL角质酶的粗酶液、30μL50mmol/L的对硝基苯丁酸酯(pNPB)、1440μL10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)；将反应体系于37℃下进行反应，反应过程中，通过紫外分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含角质酶、连接肽和碳水化合物结合组件。/n

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含角质酶、连接肽和碳水化合物结合组件。


2.如权利要求1所述的一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由角质酶、连接肽和碳水化合物结合组件依次相连而得。


3.一种基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1或2所述的融合蛋白。


4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒携带权利要求3所述的基因。


5.如权利要求4所述的一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的表达载体为pET-5a(+)质粒、pET-11b(+)质粒、pET-14b(+)质粒、pHY300PLK质粒、pET-20b(+)质粒、pET-21b(+)质粒、pET-24a(+)质粒、pET-28a(+)质粒、pET-30c(+)质粒、pET-32b(+)质粒、pET-34b(+)质粒、pET-40b(+)质粒、pET-41b(+)质粒、pET-42c(+)质粒、pET-4...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，刘展志，张颖，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32