一种冻干人用CpG佐剂狂犬病疫苗的制备方法技术

本发明专利技术提供一种冻干人用CpG佐剂狂犬病疫苗的制备方法。先采用狂犬病毒株接种于真核细胞，收获病毒液，经灭活，纯化后制得人用狂犬病疫苗；再按终含量为0.1～5mg/ml的ISS 1018佐剂配制CpG佐剂溶液；最后在得到的人用狂犬病疫苗中加入配制浓度的CpG佐剂溶液，混合均匀加入赋形剂，经冻干，其中人用狂犬病疫苗含量为0.1～15IU，佐剂含量为0.1～5mg/ml。本发明专利技术提供的方法简单，效价显著提高，生产的疫苗可以降低原工艺疫苗的抗原使用量，降低人免疫球蛋白的使用量，节约生产成本，通过佐剂的有效性和疫苗剂量配比关系试验证明本疫苗有良好的免疫效果，而且该疫苗尚无不良反应。

【技术实现步骤摘要】
一种冻干人用CpG佐剂狂犬病疫苗的制备方法
本专利技术属于免疫学领域，具体涉及一种冻干人用CpG佐剂狂犬病疫苗的制备方法。
技术介绍
狂犬病是一种致死率接近100％人畜共患疾病，它的高度致死性对整个社会造成很大危害。巴斯德首先发现了狂犬病病毒，并成功研制出了疫苗。狂犬病疫苗的研制及应用已有将近200多年，疫苗的生产制备方式不断更新。目前，上市的狂犬疫苗有Vero细胞疫苗、原代地鼠肾细胞疫苗、人二倍体细胞疫苗、纯化鸡胚细胞培养疫苗等。现代人用细胞培养疫苗已得到广泛的应用。但目前在我国上市的人用狂犬疫苗，均无佐剂成分，暴露后患者需同时注射免疫球蛋白，增加患者的经济负担。佐剂是一种非特异性免疫增强剂，能够增强机体对抗原的免疫应答，引导特异的免疫反应。为了探究减少狂犬病疫苗的抗原用量的同时，增强疫苗的免疫效果，在疫苗内加入佐剂或免疫促进剂方面，国内外众多学者进行可很多尝试和研究。目前佐剂主要有铝佐剂、皮卡佐剂、CpG佐剂。截至目前，铝佐剂在人用疫苗应用最广泛，也被认为是最安全的一种佐剂。铝佐剂的主要成分是AI(OH)3，可以诱导强烈体液免疫反应，而对细胞免疫的作用则不明显。因为铝佐剂具有缓慢释放抗原的特点，所以早期并不能产生效价较高的抗体。因此不利于预防和保护狂犬病病毒感染者。皮卡(PIKA)佐剂作为一种免疫刺激复合物，被证明在狂犬病预防方面有显著作用，皮卡狂犬病疫苗是一种新型佐剂狂犬病疫苗，由我国学者林海祥于1991年至1993年在法国巴斯德研究所工作时的研究成果。皮卡佐剂既能够增强非特异性免疫应答，也能增强特异性体液免疫应答。皮卡是一种聚肌胞衍生物，为极强的干扰素诱生剂，促进细胞免疫和体液免疫。CpG佐剂可以由人工合成，如含未甲基化CpG基序的寡核苷酸(ODN)，也可以来源于原核生物，如细菌基因组DNA。CpG-DNA的免疫刺激活性受其长度，CpG基序的数目和CpG基序序列的影响。佐剂的加入可以降低抗原使用量和免疫球蛋白使用量。然而将CpG佐剂用于制备狂犬疫苗却未见报道或使用，亟需一种人用CpG佐剂狂犬病疫苗。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种冻干人用CpG佐剂狂犬病疫苗的制备方法。本专利技术在现有狂犬疫苗工艺中添加CpG佐剂，使患者提前产生抗体，从而提前保证患者的生命安全。本专利技术采用人工合成的甲基化寡聚核苷酸ISS-1018型别的CpG佐剂制备成疫苗，通过试验证明该佐剂疫苗有良好的免疫效果，提前产生抗体的同时保证人狂犬病疫苗的稳定性；而且该佐剂疫苗尚无不良反应。为实现上述目的本专利技术采用以下技术方案：一种冻干人用CpG佐剂狂犬病疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)人用狂犬病疫苗制备：人用狂犬病疫苗为狂犬病毒株PV-2061株、PM株、Vnukovo-32株、Flury株、aG株、CTN-1株、CVS株中的一种，接种于真核细胞，进行培养，再收获病毒液，经灭活，纯化后制得；(2)CpG佐剂溶液配制：将ISS1018佐剂加入到适量的PBS中，配置成终含量0.1～5mg/mlISS1018佐剂的溶液，充分搅拌，并过滤除菌即制得CpG佐剂溶液；(3)冻干人用CpG佐剂狂犬疫苗制备：在步骤(1)得到的人用狂犬病疫苗中加入步骤(2)配制浓度的CpG佐剂溶液，混合均匀后，加入赋形剂，分装到药学上可接受的包装容器中，经冻干得到所述冻干人用CpG佐剂狂犬疫苗，其中人用狂犬病疫苗含量为0.1～15IU，佐剂含量为0.1～5mg/ml。进一步地，所述真核细胞包括Vero细胞。进一步地，所述赋形剂包括蔗糖、右旋糖酐40。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：目前在我国上市的人用狂犬疫苗，均无佐剂成分，故而，该新型疫苗与无佐剂疫苗相比，可以刺激小鼠更早的产生更高的血清中和抗体，同时分泌更多的IL-2，IFN-γ细胞因子。采用叙利亚金黄色地鼠模型证实了佐剂疫苗的加入可以减少免疫球蛋白的使用量，减轻暴露后患者的经济负担。CpG佐剂与狂犬病疫苗联合使用，既可以增强细胞免疫和体液免疫应答水平，尤其是产生早期的体液保护效果，又可以减少抗原使用量，降低疫苗成本。本专利技术提供的方法简单，效价显著提高，生产的疫苗可以降低原工艺疫苗的抗原使用量，降低人免疫球蛋白的使用量，节约疫苗生产成本，通过佐剂的有效性和疫苗剂量配比关系试验证明本疫苗有良好的免疫效果，提前产生抗体的同时保证人狂犬病疫苗的稳定性；而且该疫苗尚无不良反应。在当前抗狂犬病免疫球蛋白价格昂贵和紧缺的情况下，CpG佐剂人用狂犬病疫苗具有广阔的前景。附图说明图1为本专利技术实施例4中CpG-1018狂犬病疫苗免疫小鼠中和抗体结果图；图2为本专利技术实施例4中对照组狂犬病疫苗免疫小鼠阳转率结果；图3为本专利技术实施例4中实验组-1狂犬病疫苗免疫小鼠阳转率结果；图4为本专利技术实施例4中实验组-2狂犬病疫苗免疫小鼠阳转率结果；图5为本专利技术实施例4中实验组-3狂犬病疫苗免疫小鼠阳转率结果。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。实施例1灭活的纯化的狂犬病病毒的制备1.细胞制备将保存于液氮中的Vero细胞进行复苏，经细胞方瓶、细胞工厂扩增后，用胰蛋白酶进行消化，加入细胞培养液混合均匀后，置37℃培养成均匀的单层细胞；其中，细胞培养液制备方法如下：将MEM培养基按配方用注射用水进行溶解，经0.2μm无菌滤膜过滤后加入8％新生牛血清制成细胞培养液。2.病毒接种当细胞培养成致密单层后，弃去细胞培养液，用胰酶消化，将毒种(CTN株)和细胞按0.001MOI进行混匀，37℃培养3天。用胰酶消化后加入病毒维持液，33～35℃继续培养，其中，病毒维持液制备方法如下：将MEM培养基按配方用注射用水进行溶解，经0.2μm无菌滤膜过滤后加入0.1％人血白蛋白制成病毒维持液。3.病毒收获更换病毒维持液后，每隔4天收获病毒液、补加维持液，共收获4次。4.病毒收获液浓缩将同一批生产的多个单次病毒收获液合并。合并后的病毒液用截留分子量为100-300KD的超滤膜包进行30～60倍超滤浓缩。5.病毒灭活于浓缩后的病毒收获液中按比例加入β-丙内酯灭活96小时，灭活到期后在37℃水浴，以确保β-丙内酯完全水解。6.病毒的层析纯化采用柱层析法对灭活后的病毒液进行纯化，在280nm紫外检测下收取狂犬病病毒蛋白峰，即为病毒纯化液。用于配制BCG-CpG-DNA佐剂狂犬病疫苗。实施例2摸索佐剂含量的范围根据人和动物按体表面积折算等效剂量比值，小鼠和人之间剂量以80倍计算。控制相同的抗原的含量(0.0056IU)，配方及实验程序如下表1：表1通过三针法免疫小鼠后，检测血清的中和抗体滴度。中和抗体结果如下表2：表2...

【技术保护点】
1.一种冻干人用CpG佐剂狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)人用狂犬病疫苗制备：将狂犬病毒株接种于真核细胞，收获病毒液，经灭活，纯化后制得人用狂犬病疫苗；/n(2)CpG佐剂溶液配制：按终含量为0.1～5mg/ml的ISS 1018佐剂加入到适量的PBS中，充分搅拌，过滤除菌后即得；/n(3)冻干人用CpG佐剂狂犬疫苗制备：在步骤(1)得到的人用狂犬病疫苗中加入步骤(2)配制浓度的CpG佐剂溶液，混合均匀后，加入赋形剂，分装到药学上可接受的包装容器中，经冻干，其中人用狂犬病疫苗含量为0.1～15IU，佐剂含量为0.1～5mg/ml。/n

【技术特征摘要】
1.一种冻干人用CpG佐剂狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)人用狂犬病疫苗制备：将狂犬病毒株接种于真核细胞，收获病毒液，经灭活，纯化后制得人用狂犬病疫苗；
(2)CpG佐剂溶液配制：按终含量为0.1～5mg/ml的ISS1018佐剂加入到适量的PBS中，充分搅拌，过滤除菌后即得；
(3)冻干人用CpG佐剂狂犬疫苗制备：在步骤(1)得到的人用狂犬病疫苗中加入步骤(2)配制浓度的CpG佐剂溶液，混合均匀后，加入赋形剂，分装到药学上可接受的包装容器中，经冻干，其中人用狂犬病疫苗含量为0...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋力强，徐秀芝，何伟，杨屹，郭海洋，王华，吴海华，
申请(专利权)人：长春卓谊生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22