寡糖的生产制造技术

提供了一种生产和纯化人乳寡糖(HMO)的方法。所述方法包括：发酵遗传修饰的微生物，优选遗传修饰的酵母菌株，并且使用酶处理、过滤和模拟移动床(SMB)色谱步骤中的一者或多者对发酵产物进行下游加工。还提供了所得HMO在食物或饲料应用中，优选在婴儿食物和/或配方食品中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】寡糖的生产相关申请的交叉引用本申请要求2018年5月23日提交的美国临时专利申请号62/675,393的提交日期的权益，将其公开内容通过引用以其整体特此并入。
技术介绍
本公开文本涉及生产和纯化人乳寡糖(HMO)的方法。所述方法包括：发酵遗传修饰的微生物，优选遗传修饰的酵母菌株，并且使用酶处理、过滤、和单柱色谱或多柱色谱(特别是在模拟移动床(SMB)色谱模式中)中的一者或多者对发酵产物进行下游加工。人乳包含一系列独特的寡糖，即HMO，它们是结构多样的未缀合的聚糖。尽管HMO是人乳中第三大最丰富的固体组分(仅次于乳糖和脂肪)，但人类婴儿实际上无法消化HMO。而是，它们起益生元的作用，以帮助建立共生细菌。HMO还可以用作抗粘剂，帮助防止微生物病原体附着在粘膜表面。这些复杂的寡糖的出现和浓度是人类特有的，而在其他哺乳动物(例如家养的乳畜)的乳中并未大量发现。由于人乳寡糖化学合成所涉及的挑战，已经主要在细菌菌株如大肠杆菌中开发了若干种酶促方法和发酵途径。然而，这些方法会产生寡糖的复杂混合物，即所需的产品被起始材料(如乳糖)、生物合成中间体和底物(如单独的单糖、多肽等)污染。从这些混合物中纯化单独的寡糖产物的现有技术方法在技术上是复杂的。糖产业中使用了多种结晶操作，以从复杂的混合物(如乳清或糖蜜)中分离出二糖(如乳糖或蔗糖)。这些方法的缺点是它们复杂且产量低。为了纯化复杂的寡糖(例如某些HMO)，尺寸排阻色谱得到了最广泛的应用。然而，尺寸排阻色谱对于食物应用而言并不经济，并且某些HMO(例如2’-岩藻糖基乳糖(2’FL))无法大量生产。因此，仍然需要提供以更低成本、更高效率和/或纯度生产和纯化HMO、特别是2’FL的改进方法。该技术问题的解决方案由以下表征的实施方案提供。
技术实现思路
本申请提供了用于生产和纯化人乳寡糖(HMO)的方法。具体而言，本专利技术的方法包括在合适的发酵培养基中发酵已经遗传修饰以产生所需HMO的微生物，并且纯化所得发酵产物以去除副产物并获得所需HMO。在一些实施方案中，微生物是已经遗传修饰以产生所需HMO的酵母。通过模拟移动床(SMB)色谱从发酵培养基中纯化所需HMO，如2’-岩藻糖基乳糖(2’FL)。发酵后，将包含所需HMO的发酵培养基应用于SMB色谱。优选地，在将发酵培养基应用于SMB色谱之前，使发酵培养基经历以下中的一者或多者：i)对所述发酵产物进行酶处理；ii)去除生物质；iii)对所述发酵产物进行超滤；和/或iv)对所述发酵产物进行纳滤。在一些实施方案中，对发酵产物进行的酶处理用于将乳糖和/或蔗糖转化为单糖。在一些实施方案中，酶处理包括将发酵产物与一种或多种酶一起孵育。在一些实施方案中，酶是乳糖酶、β-半乳糖苷酶、海藻糖酶和/或转化酶。在一些实施方案中，通过离心、过滤、超滤、纳滤或其组合来进行生物质的去除。在一些实施方案中，通过离心去除生物质。在一些实施方案中，通过过滤去除生物质。在一些实施方案中，对发酵产物进行的超滤用于去除蛋白质和/或其他高分子量分子，如DNA。在一些实施方案中，对发酵产物进行的纳滤用于去除低分子量分子，如比目标化合物大的寡糖和/或较小的糖组分和肽。在一些实施方案中，使发酵产物经历多于一个纳滤步骤。例如，可进行第一纳滤步骤以去除比所需HMO稍大或更大的分子，例如较大的寡糖。可以进行第二纳滤步骤以去除比所需HMO更小的分子，例如单糖、氨基酸和离子。在一些实施方案中，纳滤步骤是连续进行的。在一些实施方案中，本专利技术的方法还包括以下中的一者或多者：a)脱色；b)另外的过滤；和/或c)浓缩和/或干燥所得HMO溶液。在优选的实施方案中，在SMB色谱步骤之后进行脱色、另外的过滤和/或干燥。应理解，除干燥步骤之外，本专利技术的方法的步骤可以按任何顺序进行。在一些实施方案中，本专利技术的方法的一个或多个步骤可以进行多于一次。在优选的实施方案中，本专利技术的方法的步骤以上文列出的顺序进行。还提供了根据本专利技术的方法获得的HMO。在一些实施方案中，根据本专利技术的方法获得的HMO是处于食物、补充剂或药物组合物中。药物组合物可以包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，根据本专利技术的方法获得的HMO可以用于食物产品中。食物产品是用于非人类动物或人类消费的任何食物，且包括固体和液体组合物。食物产品可以是动物或人类食物的添加剂。食物包括但不限于普通食物；液体产品，包括乳、饮料、治疗饮料和营养饮料；功能性食物；补充剂；保健食品；婴儿配方食品，包括早产儿配方食品；孕妇或哺乳期妇女的食物；成人食物；老年食物；和动物食物。附图说明为进一步理解本公开文本的本质、目标和优点，应当参考以下详细描述，结合以下附图阅读，其中相同的参考号表示相同的元件。图1示出了本专利技术的示例性步骤。具体实施方式在进一步描述本公开文本之前，应理解，本公开文本并不限于下文所述公开文本的特定实施方案，因为可对特定实施方案进行变动，且仍落入所附权利要求的范围内。还应当理解，所使用的术语是出于描述特定实施方案的目的，而不意图限制。而是，本公开文本的范围将由所附权利要求确定。在本说明书和所附权利要求中，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代物，除非上下文明确地指示其他的情况。除非另外定义，本文所用的全部技术术语和科学术语具有与本公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解的相同意义。如本文所用，术语“发酵产物”是指通过发酵微生物获得的产物。因此，发酵产物包括细胞、发酵培养基、残留底物材料以及发酵过程中产生的任何分子/副产物，例如所需的HMO。在纯化方法的每个步骤之后，将发酵产物的一种或多种组分去除，从而得到更纯的HMO。在一个方面，本公开文本的特征在于一种用于生产和纯化人乳寡糖的方法，所述方法包括以下中的一者或多者：发酵遗传修饰的微生物；酶处理，以将乳糖和蔗糖转化为单糖；离心和/或过滤，以去除生物质(例如细胞、高分子量分子)；超滤，以去除蛋白质和/或其他较高分子量的分子，例如DNA；一个或多个纳滤步骤，以去除比所需HMO稍大和/或更小的分子；以及模拟移动床(SMB)色谱。根据本专利技术的方法生产和纯化的所需HMO选自：2’-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、2’,3-二岩藻糖基乳糖、乳-N-三糖II、乳-N-四糖、乳-N-新四糖、乳-N-岩藻五糖I、乳-N-新岩藻五糖、乳-N-岩藻五糖II、乳-N-岩藻五糖III、乳-N-岩藻五糖V、乳-N-新岩藻五糖V、乳-N-二岩藻六糖I、乳-N-二岩藻六糖II、6'-半乳糖基乳糖、3'-半乳糖基乳糖、乳-N-六糖和乳-N-新六糖。在优选的实施方案中，根据本专利技术的方法生产和纯化的所需HMO是2’-岩藻糖基乳糖(2’FL)。所需HMO(例如2’FL)是通过发酵遗传修饰的微生物产生的。可以在任何合适的发酵培养基，例如化学成分确定的发酵培养基中进行发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产一种或多种人乳寡糖(HMO)的方法，其包括：/na)在合适的发酵培养基中对已经遗传修饰以产生一种或多种HMO的微生物进行发酵以形成发酵产物；/nb)对所述发酵产物进行酶处理；/nc)从所述发酵产物中去除生物质；/nd)超滤；/ne)纳滤；以及/nf)柱色谱步骤。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180523 US 62/675,3931.一种生产一种或多种人乳寡糖(HMO)的方法，其包括：
a)在合适的发酵培养基中对已经遗传修饰以产生一种或多种HMO的微生物进行发酵以形成发酵产物；
b)对所述发酵产物进行酶处理；
c)从所述发酵产物中去除生物质；
d)超滤；
e)纳滤；以及
f)柱色谱步骤。


2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种HMO是2’-岩藻糖基乳糖。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述微生物是酵母。


4.根据权利要求3所述的方法，其中所述酵母选自：酵母菌属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、耶氏酵母属(Yarrowia)和接合酵母属(Zygosaccharomyces)。


5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述酵母选自：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、树干毕赤酵母(Pichiastipites)、博伊丁假丝酵母(Candidaboidinii)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)、德尔布有孢圆酵母(Torulasporadelbrueckii)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、以及拜氏接合酵母(Zygosaccharomycesbailii)。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述酶处理包括将所述发酵产物与一种或多种选自以下的酶一起孵育：乳糖酶、β-半乳糖苷酶、海藻糖酶和转化酶。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述酶处理将乳糖和/或蔗糖转化为单糖。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中从所述发酵产物中去除生物质包括离心、过滤或其组合。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述柱色谱步骤是单柱或多柱。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述柱色谱步骤是模拟移动床色谱。


11.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·M·C·詹斯，M·B·约翰逊，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL