用于干细胞移植的组合物和方法技术

本发明专利技术提供了用于制造基因修正的干细胞和使用所述基因修正的干细胞进行基因疗法的系统和方法。具体地，本文提供了用于治疗范可尼贫血的方法，其中通过高严格性CD34+选择和低严格性CD34+选择的组合来选择受试者的干细胞，使用对FANC蛋白进行编码的基因疗法载体或基因编辑系统对所述干细胞进行基因修饰，并且将其施用于所述受试者。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于干细胞移植的组合物和方法
本专利技术总体上涉及制备用于造血干细胞(HSC)移植(包含用于治疗范可尼贫血(FA))的包括基因修饰的HSC的造血细胞群的方法。相关申请的交叉引用本申请要求于2018年4月11日提交的美国临时申请第62/656,292号的优先权，所述美国临时申请以全文引用的方式并入本文中。对以电子方式提交的文本文件的说明与本申请一起以电子方式提交的文本文件的内容以全文引用的方式并入本文中：序列表的计算机可读格式副本(文件名：ROPA_008_01WO_SeqList_ST25，记录日期：2019年4月11日，文件大小：约52千字节)。
技术介绍
离体介导的基因向靶细胞中的转移是用于细胞和基因疗法的临床应用方法。含有CD34富集群的HSC的分离和离体基因修饰提供了两个主要益处：减少向非靶细胞的基因转移；并且由此减少对基因修饰物(例如，基因疗法载体)的需求/数量，这又降低了与基因修饰的HSC的临床产生相关的成本。用于基因修饰的HSC的移植的模型系统为FA。在FA背景下开发的方法也适用于其它病症和病状。FA是常染色体隐性疾病(除了互补群FA-B，其为X连锁)，其中患者的中位生存期为约24年(ButturiniA等人,(1994)《血液(Blood)》84:1650-1655；KutlerDI等人,(2003)《血液》101:1249-1256)。出生时，这些病人的血细胞计数一般是正常的。巨红细胞症通常是在这些患者中检测到的第一个血液异常。这通常与血小板减少症、贫血和全血细胞减少症一起演进。通常在5-10年后在这些患者中观察到骨髓衰竭(BMF)，其中血液学疾病发作的平均年龄为7岁。约80％的FA患者会在生命的第一个十年发展出BMF的证据。基于迄今为止的流行病学研究，如果在发育不全之前未出现恶性发作，则几乎所有FA患者将在40岁时发展为BMF(ButturiniA等人(1994)《血液(Blood)》84:1650-1655；KutlerDI等人,(2003)《血液》101:1249-1256)，这是这些患者死亡的主要原因。由于FA的临床表现复杂，对这些患者的管理主要集中于改善以下临床表现：骨髓衰竭(BMF)、髓性白血病和实体瘤。FA和其它疾病的治疗依赖于基因修饰的HSC的有效植入。因此，在本领域中需要制备含有基因修饰的HSC的细胞群的方法，所述细胞群在患者(包含FA患者)中实现高水平的移植。本专利技术解决了此需要和更多。
技术实现思路
本专利技术总体上涉及恶性血液肿瘤和干细胞移植领域，并且具体地涉及制造富集CD34+细胞的干细胞群和使用所述干细胞群进行基因疗法，包含基因递送和基因修复两者。具体地，这些CD34富集细胞群在用于治疗哺乳动物以及具体地是与范可尼贫血互补群A(FANCA)、范可尼贫血互补群C(FANCC)或范可尼贫血互补群G(FANCG)基因产物失调相关的人类疾病、病症和功能障碍的基因疗法中是有用的。在某些实施例中，离体地而不是在人体本身上执行本公开的方法。在一个实施例中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的范可尼贫血的方法，所述方法包括向所述受试者提供以下的组合：(i)高严格性CD34富集细胞群，其通过在高严格性条件下选择CD34+细胞来由从所述受试者获得的第一生物样品制备；以及(ii)低严格性CD34富集细胞群，其通过在低严格性条件下选择CD34+细胞来由从所述受试者获得的第二生物样品制备，其中已经用对FANC多肽进行编码的重组基因疗法载体转导所述高严格性CD34富集细胞群和/或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个，所述FANC多肽包含功能变体或片段或天然存在的FANC蛋白(例如，FANCA或FANCC或FANCG)，并且其中所述第一生物样品和所述第二生物样品任选地是相同的生物样品，由此治疗范可尼贫血。在一个实施例中，所述方法包括通过以下治疗受试者的范可尼贫血：在高严格性条件下制备CD34富集细胞群；在低严格性条件下制备另一种CD34富集细胞群；使CD34富集细胞群中的一种或两种与重组基因疗法载体接触；以及顺序地或同时地向所述受试者施用两种CD34富集细胞群，由此治疗范可尼贫血。在特定实施例中，因此转导了与所述基因疗法载体接触的所述一种或多种细胞群，并且因此所述一种或多种细胞群包括对用于治疗范可尼贫血的治疗性核酸或多肽进行编码的多核苷酸。在一个实施例中，所述重组基因疗法载体包括对治疗性FANC(例如，FANCA或FANCC或FANCG)基因片段或蛋白质进行编码的自灭活慢病毒载体，如国际专利申请第PCT/US2017/050837号中描述的载体。在一个实施例中，所述重组基因疗法载体被配置成修复内源性FANC基因(例如，FANCA或FANCC或FANCG)，如通过递送CRISPR/Cas系统，所述CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白或对Cas蛋白进行编码的核酸、gRNA或sgRNA以及修复模板，所述修复模板包括FANC基因或与所述内源性FANC基因的一个或多个突变重叠的FANC基因的片段。在一个实施例中，本公开提供了一种用于治疗有需要的受试者的范可尼贫血的方法，所述方法包括：通过在高严格性条件下选择CD34+细胞，由从所述受试者获得的第一生物样品制备高严格性CD34富集细胞群；通过在低严格性条件下选择CD34+细胞，由从所述受试者获得的第二生物样品制备低严格性CD34富集细胞群；使所述高严格性CD34富集细胞群或所述低严格性CD34富集细胞群中的一种或两种与针对范可尼贫血的重组基因疗法载体接触；以及向所述受试者施用所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群，其中所述高严格性CD34富集细胞群或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个与所述重组基因疗法载体接触或由所述重组基因疗法载体转导；从而治疗范可尼贫血。在本专利技术的一方面，所述第一生物样品和所述第二生物样品各自独立地为外周血或骨髓。一方面，所述第一生物样品和所述第二生物样品是在已经用粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(G-CSF)、plerifaxor或G-CSF和plerifaxor的组合治疗所述受试者之后获得的外周血。在一个实施例中，所述方法中的任何方法进一步包括在高严格性条件下选择CD34+细胞，在高严格性条件下选择CD34+细胞可以包括：将所述第一生物样品应用于结合CD34+细胞的捕获基质；使用洗涤缓冲液洗涤所述捕获基质一次或多次；以及使用洗脱缓冲液从所述捕获基质中洗脱所述高严格性CD34富集细胞群。在一个实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、20-25mL/min或25-30mL/min执行所述应用步骤。在一个实施例中，以5-10mL/min、5-15mL/min、15-20mL/min、20-25mL/min或25-30mL/min执行所述洗脱步骤。在一个实施例中，以10-20mL/min执行所述应用步骤。在一个实施例中，以20mL/min执行所述洗脱步骤。在一个实施例中，所述方法中的任何方法进一步包括在低严本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种治疗有需要的受试者的范可尼贫血的方法，其包括向所述受试者提供以下：/n(i)高严格性CD34富集细胞群，其通过在高严格性条件下选择CD34

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180411 US 62/656,2921.一种治疗有需要的受试者的范可尼贫血的方法，其包括向所述受试者提供以下：
(i)高严格性CD34富集细胞群，其通过在高严格性条件下选择CD34+细胞来由从所述受试者获得的第一生物样品制备；和
(ii)低严格性CD34富集细胞群，其通过在低严格性条件下选择CD34+细胞来由从所述受试者获得的第二生物样品制备，
其中所述高严格性CD34富集细胞群和/或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个通过以下进行基因修饰：
(i)重组基因疗法载体，所述重组基因疗法载体包括对范可尼贫血互补群(FANC)多肽或其功能变体或片段进行编码的多核苷酸序列；或
(ii)基因编辑系统，所述基因编辑系统靶向内源性突变FANC基因的直接修复，并且其中所述第一生物样品和所述第二生物样品任选地是相同的生物样品。


2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
(a)通过在高严格性条件下选择CD34+细胞，由从所述受试者获得的第一生物样品制备高严格性CD34富集细胞群；
(b)通过在低严格性条件下选择CD34+细胞，由从所述受试者获得的第二生物样品制备低严格性CD34富集细胞群，
(c)用以下对所述高严格性CD34富集细胞群和/或所述低严格性CD34富集细胞群中的一个或两个进行基因修饰：
(i)所述重组基因疗法载体，所述重组基因疗法载体包括对所述范可尼贫血互补群A(FANCA)多肽或其功能变体或片段进行编码的所述多核苷酸序列；或
(ii)所述基因编辑系统，所述基因编辑系统靶向所述内源性突变FANC基因的直接修复；以及
(d)向所述受试者提供所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群，
由此治疗所述范可尼贫血。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一生物样品和所述第二生物样品各自独立地为外周血或骨髓。


4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述第一生物样品和所述第二生物样品是在已经用G-CSF、plerifaxor或G-CSF和plerifaxor的组合治疗所述受试者之后获得的外周血。


5.根据权利要求2所述的方法，其中在高严格性条件下选择CD34+细胞包括：将所述第一生物样品应用于结合CD34+细胞的捕获基质；使用洗涤缓冲液洗涤所述捕获基质一次或多次；以及使用洗脱缓冲液从所述捕获基质中洗脱所述高严格性CD34富集细胞群。


6.根据权利要求2所述的方法，其中在低严格性条件下选择CD34+细胞包括：将所述第二生物样品应用于结合CD34+细胞的捕获基质；允许所述第二生物样品的未结合级分流过所述捕获基质；以及使用洗脱缓冲液从所述捕获基质中洗脱所述低严格性CD34富集细胞群。


7.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述高严格性CD34富集细胞群是经过基因修饰的。


8.根据权利要求1、2、6或7中任一项所述的方法，其中所述低严格性CD34富集细胞群是经过基因修饰的。


9.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，其中所述高严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比是所述低严格性CD34富集细胞群中CD34+细胞的百分比的两到四倍。


10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中所述高严格性CD34富集细胞群包括纯度>20％或>30％的CD34+细胞。


11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述低严格性CD34富集细胞群包括纯度<30％的CD34+细胞。


12.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述高严格性CD34富集细胞群包括产率>20％的CD34+细胞。


13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中所述低严格性CD34富集细胞群包括产率>35％的CD34+细胞。


14.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述重组基因疗法载体包括多核苷酸序列，所述多核苷酸序列按以下5'到3'顺序包括：
(a)真核活性启动子序列；以及
(b)对人FANC基因多肽或其功能片段或变体进行编码的序列；
其中所述对所述人FANC基因多肽或其功能片段或变体进行编码的序列与所述真核活性启动子序列可操作地连接；并且其中所述FANC基因选自FANCA、FANCC和FANCG。


15.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因编辑系统包括：
(a)Cas蛋白或对Cas蛋白进行编码的多核苷酸；
(b)gRNA；以及
(c)修复模板，所述修复模板包括包含所述FANC基因或其片段的序列，所述FANC基因或其片段与所述内源性FANC基因中的一个或多个突变重叠。
其中sgRNA被配置成将所述修复模板引导到所述FANC基因，其中所述FANC基因选自FANCA、FANCC和FANCG，并且其中所述基因编辑系统能够定向修复内源性FANC基因。


16.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中所述方法抑制所述受试者的范可尼贫血的血液学表现的发展、停止所述血液学表现的进展和/或逆转所述血液学表现的进展，其中范可尼贫血的所述血液学表现任选地选自以下中的一种或多种：骨髓衰竭、血小板减少症、白细胞减少症、全血细胞减少症、中性粒细胞减少症和贫血。


17.根据权利要求2所述的方法，其中所述选择是通过基于珠粒的磁性选择执行的。


18.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括对所述外周血执行一次或多次单采血液成分术。


19.根据权利要求1到18中任一项所述的方法，其中所述方法引起基因修饰的范可尼贫血细胞随时间推移而逐渐增加。


20.根据权利要求1到19中任一项所述的方法，其中所述方法引起在向所述受试者施用所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群之前已经在所述受试者中下降的一种或多种造血谱系得到恢复。


21.根据权利要求20所述的方法，其中所述一种或多种造血谱系包括淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、红细胞和血小板中的一种或多种。


22.根据权利要求1到19中任一项所述的方法，其中所述方法引起在向所述受试者施用所述高严格性CD34富集细胞群和所述低严格性CD34富集细胞群之前已经在所述受试者中下降的一个或多个血液学参数得到恢复。


23.根据权利要求22所述的方法，其中所述血液学参数为血红蛋白。


24.一种用于制备用于治疗范可尼贫血的基因修饰细胞的方法，其包括：
(a)通过在高严格性条件下选择CD34+细胞，由从受试者获得的第一生物样品制备高严格性CD34富集细胞群；
(b)通过在低严格性条件下选择...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·彼尔德，J·塞维拉纳瓦罗，G·萨，K·帕特尔，R·普拉布哈卡，
申请(专利权)人：火箭制药有限公司，尼诺耶稣大学儿童医院生物医学研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US