一种猪流行性腹泻病毒染色方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种猪流行性腹泻病毒染色的方法及其应用，该方法包括如下步骤：(1)将染色剂与猪流行性腹泻病毒液混匀，避光孵育得到染色病毒液；(2)吸附柱离心法去除过量的染色剂；(3)将染色的猪流行性腹泻病毒液避光‑70℃冷冻保存。本方法可对猪流行性腹泻病毒染色；染色后的猪流行性腹泻病毒保持正常感染活性，正常感染宿主细胞，通过荧光可示踪病毒感染情况，可促进该病毒相关研究。

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒染色方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及到一种利用化学染料对猪流行性腹泻病毒染色的方法及其应用。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)为冠状病毒科Alpha-冠状病毒属成员，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。PEDV感染仔猪肠道上皮细胞，引发以呕吐、腹泻、脱水为主要特征的流行性腹泻疾病，造成仔猪死亡率高达80％-100％。PEDV是近年来严重制约我国养猪产业发展的重大病原之一，其造成的仔猪损失和饲养成本的增加，给我国养猪产业造成了巨大经济损失，开展其致病性研究，制定综合防控措施，对于保障我国养猪产业的健康持续发展有着重要意义。荧光染料作为有荧光标记和识别性能的功能性染料，在分析检测、生物分子标记、临床诊断等领域发挥重要作用。荧光标记技术是病毒研究的重要手段之一,可用于观察标记病毒的理化特性和生物学活性，以及检测病毒特异性细胞毒性。在病毒侵染早期，病毒荧光标记有助于观察病毒与细胞间的相互作用，并可为病毒侵染宿主细胞后，开展宿主细胞细胞生物学和分子生物学的相关研究奠定基础。本方法利用荧光染料对PEDV进行染色，为开展该病毒的示踪研究提供技术支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒染色的方法及其应用。本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：一种猪流行性腹泻病毒染色的方法，该方法包括如下步骤：(1)将染色剂与猪流行性腹泻病毒液混匀，避光孵育得到染色病毒液；>(2)吸附柱离心法去除过量的染色剂；(3)将染色的猪流行性腹泻病毒液避光-70℃冷冻保存。作为一种优选技术方案，步骤(1)中将染色剂与猪流行性腹泻病毒液按1:8～12的体积比混合；优选的，按1:10的体积比混合。进一步优选的，所述的染色剂为DyLightDye594染色剂。所述的猪流行性腹泻病毒液的滴度达到1×105～1×106TCID50/ml。进一步优选的，步骤(1)中所述避光孵育的时间为50～70分钟。作为一种优选技术方案，步骤(2)中去除过量的染色剂的过程为：将染料去除树脂添加至含有吸附柱的离心管中，在低温条件下离心后(优选的，4℃条件下1000×g离心，离心时间为30秒，但不仅限于此)收集吸附柱并置于新的离心管中，添加步骤(1)得到的染色病毒液至吸附柱中，在低温条件下离心后(优选的，4℃条件下1000×g离心，离心时间为45秒，但不仅限于此)收集染色的猪流行性腹泻病毒液。一种用于检测猪流行性腹泻病毒的PCR扩增引物，该引物包括正向引物和反向引物，其中，正向引物:5’-ACTAGCGACCAGCTACCAGA-3’；反向引物:5’-TCAACTCGGTTGAGCCACTC-3’。本专利技术所述猪流行性腹泻病毒染色的方法的最优选技术方案包括以下步骤：(1)将DyLightDye594染色剂与猪流行性腹泻病毒液(TCID50＝2×105/ml)按1:10的体积比混匀，室温条件下避光孵育得到染色病毒液；(2)吸附柱离心法去除过量的染色剂：将染料去除树脂添加至含有吸附柱的离心管中，4℃条件下1000×g离心30秒后收集吸附柱并置于新的离心管中，添加步骤(1)得到的染色病毒液至吸附柱中，4℃条件下1000×g离心45秒后收集染色的猪流行性腹泻病毒液；(3)染色后的猪流行性腹泻病毒液避光-70℃冷冻保存。上述方法制备的染色的猪流行性腹泻病毒液在荧光示踪猪流行性腹泻病毒感染中的应用。优选的，将染色的猪流行性腹泻病毒正常感染宿主细胞，通过荧光示踪病毒感染情况。本专利技术所述的室温一般为25±5℃。本专利技术相对于现有技术，具有以下优点：1、本方法可对猪流行性腹泻病毒染色；2、染色后的猪流行性腹泻病毒保持正常感染活性，正常感染宿主细胞，通过荧光可示踪病毒感染情况，可促进该病毒相关研究。附图说明图1为猪流行性腹泻病毒感染IPEC-J2细胞显微镜观测图；其中，左侧为荧光视野(100×)；右侧为白光视野(100×)。图2为猪流行性腹泻病毒定量PCR扩增产物琼脂糖凝胶检测图；其中，M：DL1000DNA分子量标准；1、2、3：猪流行性腹泻病毒感染细胞PCR扩增产物；4、5、6：猪流行性腹泻病毒未感染的对照细胞PCR扩增结果。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例1(1)猪流行性腹泻病毒与染色剂共孵育将DyLightDye594NHSEster(ThermoScientificTM)染色剂与猪流行性腹泻病毒液(TCID50＝2×105/ml)按1:10的体积比混合，上下颠倒3次混匀，室温条件下避光孵育1小时。(2)去除过量的染色剂将100μL染料去除树脂添加至含有吸附柱的离心管中，4℃条件下1000×g离心30秒，收集吸附柱并置于新的离心管中，添加200μL染色病毒液至吸附柱中，4℃条件下1000×g离心45秒，收集染色的猪流行性腹泻病毒液，-70℃冻存备用。所述的树脂和吸附柱均为试剂盒(试剂盒ThermoScientific，PierceTMDyeRemovalColumns，货号22858)自带的常规染料去除树脂和吸附柱。(3)染色病毒感染猪小肠上皮(IPEC-J2)细胞将IPEC-J2细胞接种于6孔细胞培养板，细胞培养箱培养，细胞汇合度达70％-80％时，以染色的猪流行性腹泻病毒液感染细胞，24小时后荧光显微镜观察病毒感染情况，可见带有红色荧光的猪流行性腹泻病毒已感染IPEC-J2细胞。利用PCR技术对猪流行性腹泻病毒进行检测，PCR扩增引物：正向引物:5’-ACTAGCGACCAGCTACCAGA-3’；反向引物:5’-TCAACTCGGTTGAGCCACTC-3’，扩增片段长度263bp。PCR反应体系如下：PCR反应条件：95℃5min；95℃30s，60℃10s(40个循环)；4℃保存。利用琼脂糖凝胶电泳对定量PCR扩增产物进行检测，猪流行性腹泻病毒感染细胞PCR扩增产物有明显条带，对照细胞无PCR条带，扩增结果如图2所示。研究结果证明，本专利技术方法可对猪流行性腹泻病毒染色；染色后的猪流行性腹泻病毒保持正常感染活性，正常感染宿主细胞，通过荧光可示踪病毒感染情况，可促进该病毒相关研究。以上所述仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出：对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利技术的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪流行性腹泻病毒染色的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：/n（1）将染色剂与猪流行性腹泻病毒液混匀，避光孵育得到染色病毒液；/n（2）吸附柱离心法去除过量的染色剂；/n（3）将染色的猪流行性腹泻病毒液避光-70℃冷冻保存。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒染色的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）将染色剂与猪流行性腹泻病毒液混匀，避光孵育得到染色病毒液；
（2）吸附柱离心法去除过量的染色剂；
（3）将染色的猪流行性腹泻病毒液避光-70℃冷冻保存。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中将染色剂与猪流行性腹泻病毒液按1:8~12的体积比混合；优选的，按1:10的体积比混合。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的染色剂为DyLightDye594染色剂。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的猪流行性腹泻病毒液的滴度达到1×105~1×106TCID50/ml。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述避光孵育的时间为50~...

【专利技术属性】
技术研发人员：包文斌，王芳，吴正常，殷宗俊，吴圣龙，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32