一种提高4,6-α-葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高4,6‑α‑葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法，属于蛋白质工程和发酵工程技术领域，具体涉及分别以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为宿主表达来源于发酵乳杆菌的4,6‑α‑葡萄糖基转移酶(GtfB)过程中，在发酵培养基中添加甜菜碱、麦芽糖、β‑环糊精、海藻糖、山梨醇小分子物质，提高4,6‑α‑葡萄糖基转移酶(GtfB)可溶性表达量的方法，使得发酵总酶活本发明专利技术为高效表达4,6‑α‑葡萄糖基转移酶(GtfB)提供了一个有效的策略，操作工艺简单，且成本较低，效果显著，为工业化生产奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种提高4,6-α-葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法
一种提高4,6-α-葡萄糖基转移酶可溶性表达量的方法，属于蛋白质工程和发酵工程

技术介绍
4,6-α-葡萄糖基转移酶属于糖苷水解酶(glycosidehydrolase，GH)70家族，该家族的酶可以利用蔗糖或淀粉为底物合成各种结构的α-葡聚糖，因此广泛应用于食品领域。4,6-α-葡萄糖基转移酶大部分来源乳酸杆菌目(Lactobacillaceae)。由于野生菌发酵水平较低，通过异源表达提高表达量。大肠杆菌(Escherichiacoli)由于其遗传背景清晰、基因工程技术操作成熟作为最广泛应用的宿主。一般情况下，大肠杆菌表达外源蛋白质有三种方式，胞内表达、周质空间表达、胞外分泌。随着食品安全意识提高，枯草芽孢杆菌(Lactobacillusfermentum)作为食品安全菌，表达异源蛋白质也越来越受到重视。无论是大肠杆菌还是枯草芽孢杆菌为宿主菌发酵产酶，经常遇到外源蛋白质，形成无活性的包涵体，以不可溶的形式出现在细胞液中。4,6-α-葡萄糖基转移酶发酵过程中也遇到同样的问题。人们一般采用复杂的基因工程手段，从核酸水平、基因表达水平、发酵水平，试图提高蛋白质的可溶性表达量。这些技术手段对某些蛋白质的可溶性表达的确取得了一些效果，但是周期长、操作复杂、成本高这些缺地依然存在，难以克服。最关键的一点，对于很多外源蛋白质可溶性表达量始终难以提高。因而限制了4,6-α-葡萄糖基转移酶的大规模生产及在工业生产中的应用。
技术实现思路
面对这些难点针对目前存在的问题，本专利技术提出了在培养基添加小分子物质提高外源蛋白质的可溶性表达量的策略。由于小分子物质甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖、山梨醇可以提高菌株在恶劣的环境中的耐受性，保护细胞免受损伤，同时对细胞液中蛋白质的正确折叠起到重要的辅助作用以及对可溶性蛋白质的稳定性起到积极的影响，因此提高了细胞液中蛋白质的可溶性表达量。本专利技术的第一个目的是提供一种提高重组菌外源蛋白表达量的方法，在重组菌发酵的体系中添加小分子物质。在本专利技术的一种实施方式中，所述小分子物质包括甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖或山梨醇中的一种或几种。在本专利技术的一种实施方式中，所述外源蛋白包括4,6-α-葡萄糖基转移酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述外源蛋白还包括4,6-α-葡萄糖基转移酶的同家族酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述4,6-α-葡萄糖基转移酶来源于发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述同家族酶结构相似，功能相同，均能将底物淀粉的α-1,4糖苷键转化成α-1,6糖苷键，所述同家族酶包括来源于Exiguobacteriumsp.RIT341、Burkholderiasp.NFACC38-1、Frateuriadefendens和Limosilactobacillusfermentum的酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述来源于Exiguobacteriumsp.RIT341的酶NCBI登录号为WP_035410561；所述来源于Burkholderiasp.NFACC38-1的酶NCBI登录号为WP_091925906.1；所述来源于Frateuriadefendens的酶NCBI登录号为WP_049623289.1；所述来源于Limosilactobacillusfermentum的酶NCBI登录号为ASA47863。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组菌以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coliBL21；所述枯草芽孢杆菌为保藏编号为CCTCCNO：M2016536的菌株，已公开于公开号为CN106754466A的专利中。在本专利技术的一种实施方式中，所述小分子物质的添加量为10～50mM。在本专利技术的一种实施方式中，所述海藻糖或甜菜碱的添加量为10～50mM。在本专利技术的一种实施方式中，在发酵体系中同时加入海藻糖和甜菜碱，添加量分别为10～50mM。在本专利技术的一种实施方式中，所述体系中还含有蛋白胨10g/L，酵母粉24g/L，甘油5g/L，K2HPO4·3H2O16.43g/L，KH2PO42.31g/L，氨苄青霉素100mg/L。在本专利技术的一种实施方式中，将重组菌培养得到种子液，将种子液接种至发酵的体系中，在转速200rpm、温度37℃，培养2h后，加入终浓度为0.1mmol/L诱导剂IPTG，并将温度调至25℃，培养24h。本专利技术的第二个目的是提供一种生产4,6-α-葡萄糖基转移酶的方法，所述方法是将4,6-α-葡萄糖基转移酶在宿主细胞中表达。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞在含有甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖和/或山梨醇的发酵体系中进行培养。在本专利技术的一种实施方式中，将编码4,6-α-葡萄糖基转移酶的基因连接至表达载体上，再将表达载体转入大肠杆菌或枯草芽孢杆菌中。在本专利技术的一种实施方式中，以pET15b、pET20b、pET24a等pET系列载体为表达载体，表达4,6-α-葡萄糖基转移酶基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码4,6-α-葡萄糖基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述小分子物质的添加量为10～50mM。在本专利技术的一种实施方式中，所述海藻糖或甜菜碱的添加量为10～50mM。在本专利技术的一种实施方式中，在发酵体系中同时加入海藻糖和甜菜碱，添加量分别为10～50mM。在本专利技术的一种实施方式中，将重组菌培养得到种子液，将种子液接种至发酵体系中，在转速200rpm、温度37℃，培养2h后，加入终浓度为0.1mmol/L诱导剂IPTG，并将温度调至25℃，培养24h。本专利技术还保护所述方法在提高外源蛋白可溶性表达或提高胞外酶活产量中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术相比现有提高异源蛋白质可溶性表达量的方法，特点如下：1)相比传统的从分子水平优化基因的表达强度来提高蛋白质的可溶性表达量的方法，本专利技术操作工艺简单，且效果显著；2)对同家族的酶有一定的普适性；3)小分子物质的添加提高异源蛋白质的可溶性表达量，在发酵体系中可稳定起到效果，适合产业化应用。附图说明图1为以大肠杆菌为宿主菌时，发酵培养基中添加10mmol/L海藻糖菌株胞内4,6-α-葡萄糖基转移酶酶活；图2为以枯草芽孢杆菌为宿主菌时，发酵培养基中添加10mmol/L海藻糖菌株胞内4,6-α-葡萄糖基转移酶酶活。具体实施方式实施例中所述的培养基配方如下：所述LB种子培养基：蛋白胨10g/L、NaCL10g/L、酵母粉5g/L，pH＝7.0。所述TB发酵培养基：蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种提高重组菌外源蛋白表达量的方法，其特征在于，在重组菌生产目的蛋白的体系中添加甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖和/或山梨醇。/n

【技术特征摘要】
1.一种提高重组菌外源蛋白表达量的方法，其特征在于，在重组菌生产目的蛋白的体系中添加甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖和/或山梨醇。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白包括4,6-α-葡萄糖基转移酶及其同家族的酶。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组菌以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖和/或山梨醇的添加量为10～50mM。


5.一种生产4,6-α-葡萄糖基转移酶的方法，其特征在于，将4,6-α-葡萄糖基转移酶在宿主细胞中表达，所述宿主细胞在含有甜菜碱、麦芽糖、β-环糊精、海藻糖和/或山梨醇的体系中进行培养。


6.根据权利要求5...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，王蕾，饶德明，陈晟，刘展志，霍润甜，杨卫康，盛露菲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32