一种双功能酶生物催化剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种双功能酶生物催化剂，其具有羰基还原氨化和辅酶(NADH)再生两个功能，能同时催化羰基还原氨化和辅酶(NADH)再生两个生物转化过程，生物转化时间短，转化催化效率高，同时减少参与(S)‑环丙基甘氨酸生物催化合成过程中所需酶数量。本发明专利技术双功能酶生物催化剂通过基因重组技术，质粒表达制得。将本发明专利技术的双功能酶生物催化剂，用(S)‑环丙基甘氨酸的生物催化不对称合成，无需按照化学反应计量添加昂贵的辅酶NADH。

【技术实现步骤摘要】
一种双功能酶生物催化剂及其制备方法和应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种双功能酶生物催化剂及其制备方法和应用。
技术介绍
非天然氨基酸是一类非常重要的有机化合物，是合成多种手性药物、手性农药和手性食品添加剂等精细化工品的重要原料和关键中间体。特别是，(S)-环丙基甘氨酸(分子式：C5H9NO2，分子量为：115.13，CAS：49606-99-7)是一种含环丙基的非天然氨基酸，被广泛用于多肽类似物和药物设计与合成(参见文献Chem.Rev.,2007,107,4538-4583；Russ.Chem.Bull.,2013,62,928-952；J.Med.Chem.,2016,59,8712-8756)。(S)-环丙基甘氨酸主要有化学合成和酶拆分两种制备途径。化学合成(S)-环丙基甘氨酸，如利用Strecker反应引入手性中心(J.Med.Chem.,2009,52,7653-7668；Org.ProcessRes.Dev.,2010,14,1221-1228)或利用Strecker型手性辅助试剂合成(J.Org.Chem.,1983,48(26),5369-5373)，合成过程须使用昂贵的原料和剧毒KCN以及大量的有机溶剂，同时制备工艺路线较长，反应时间长，收率较低。酶拆分制备(S)-环丙基甘氨酸，如利用AcylaseI酶(J.Am.Chem.Soc.,1989,111,6354-6364)或Papain酶(Adv.Synth.Catal.,2006,348,1071-1078)拆分消旋体进行分离合成，酶拆分的缺陷在于最大理论产率只有50％，故这些方法难以实现工业化。生物催化合成非天然氨基酸具有立体选择性高、催化活性高、环境友好、反应条件温和等独特优势。Hanson等(Org.ProcessRes.Dev.,2012,16,464-469)选用亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶借助还原型辅酶(NADH)，利用酶偶联方法(如图1所示)将环丙基羰基乙酸还原氨化制备(S)-环丙基甘氨酸。酶偶联方法须分别表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，而羰基还原氨化和辅酶再生在两个独立菌体中完成，辅酶必须在两个不同菌体之间转运扩散，但受菌体自身结构限制和自由扩散影响，辅酶在两个菌体间的传质阻力导致生物转化时间长，催化效率低。同时需要两种酶才能完成生物转化过程，导致成本增加，不利于工业化。
技术实现思路
为了解决现有技术中的问题，根据本专利技术的第一方面，本专利技术的目的在于提供一种双功能酶生物催化剂。本专利技术的目的是这样实现的：一种双功能酶生物催化剂，其特征在于：所述双功能酶生物催化剂的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术双功能酶生物催化剂具有羰基还原氨化和辅酶(NADH)再生两个功能，能同时催化羰基还原氨化和辅酶(NADH)再生两个生物转化过程，生物转化时间短，转化催化效率高，同时减少参与(S)-环丙基甘氨酸生物催化合成过程中所需酶数量。本专利技术双功能酶生物催化剂为同时具有羰基还原氨化和辅酶再生能力的高效表达双功能酶的重组大肠杆菌全细胞。本专利技术双功能酶在大肠杆菌中高表达，并直接以此全细胞作为生物催化剂，在单个重组大肠杆菌全细胞内同时完成羰基还原氨化和辅酶(NADH)再生两个过程(如图2所示)，本专利技术双功能酶生物催化剂具有辅酶(NADH)再生能力，为羰基还原氨化过程提供所需辅酶，实现辅酶循环利用以降低生产成本。本专利技术减少参与(S)-环丙基甘氨酸生物催化合成过程中所需酶数量，可降低酶的使用成本。根据本专利技术的第二方面，本专利技术的另一目的在于提供上述双功能酶生物催化剂的制备方法。根据本专利技术的一个实施方案，上述双功能酶生物催化剂的制备方法，其特征在于，采用如下步骤：步骤(1)用基因重组技术，将编码双功能酶(TLF)的全长基因tlf连接到载体pET28a上，形成质粒pET28a-tlf。步骤(2)将步骤(1)形成的质粒pET28a-tlf转入感受态细胞E.coliBL21(DE3)，接种卡拉霉素抗性的Luria-Bertani(LB)液体培养基，放大培养，诱导重组大肠杆菌表达双功能酶TLF，4℃离心收集菌体，用缓冲溶液洗涤，既得。进一步，上述方法中，诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的培养时间为24-72小时。进一步，上述方法中，诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的培养温度为16-30℃。进一步，所述卡拉霉素的浓度为50-200μg/L；所述诱导工程菌表达双功能酶TLF的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，浓度为0.4-1.0mM。本专利技术所述的LB液体培养基为本领域所熟知的培养基，含1％蛋白胨，0.5％酵母提取物和1％氯化钠。本专利技术所述的LB液体培养基的pH为7.0-8.0。本专利技术所述的缓冲溶液为10mM磷酸缓冲盐溶液(PBS)，含NaCl137mM，KCl2.7mM，Na2HPO410mM，KH2PO42mM。根据本专利技术的第三方面，本专利技术的另一目的在于提供上述双功能酶生物催化剂在合成(S)-环丙基甘氨酸中的应用。根据本专利技术的第四方面，本专利技术的另一目的在于提供一种(S)-环丙基甘氨酸的合成方法，该方法使用上述双功能酶生物催化剂，催化不对称合成(S)-环丙基甘氨酸。根据本专利技术的一个实施方案，一种(S)-环丙基甘氨酸的生物合成方法，其特征在于：将双功能酶生物催化剂分散在缓冲溶液中，加入环丙基羰基乙酸钾，甲酸铵和辅酶(NADH)，在20-60℃条件下，pH为6.0-9.0，以50～150rpm转速振荡，生物转化时间为1-18h；所述缓冲溶液的pH值为7.2-7.4。根据本专利技术的一个实施方案，所述缓冲溶液为10mM磷酸缓冲盐溶液(PBS)，含NaCl137mM，KCl2.7mM，Na2HPO410mM，KH2PO42mM。具体的，一种(S)-环丙基甘氨酸的生物催化合成方法，包括如下步骤：步骤(1)用基因重组技术，将编码双功能酶(TLF)的全长基因tlf连接到载体pET28a上，形成质粒pET28a-tlf。步骤(2)将步骤(1)形成的质粒pET28a-tlf转入感受态细胞E.coliBL21(DE3)，接种卡拉霉素抗性的Luria-Bertani(LB)液体培养基，放大培养，诱导工程菌表达双功能酶TLF，4℃离心收集菌体，用缓冲溶液洗涤，制得双功能酶生物催化剂；步骤(3)将双功能酶生物催化剂分散在缓冲溶液中，加入环丙基羰基乙酸钾，甲酸铵和辅酶(NADH)，辅酶的浓度为0.1-0.3mM，在20-60℃条件下，pH为6.0-9.0，以50～150rpm转速振荡，生物转化时间为1-18h；所述缓冲溶液为10mM磷酸缓冲盐溶液(PBS)，含NaCl137mM，KCl2.7mM，Na2HPO410mM，KH2PO42mM，pH值为7.2-7.4。有益效果：1、本专利技术提供一种新的双功能酶，具有羰基还原氨化和辅酶再生能力，能同时催化羰基还原氨化和辅酶再生两个生物转化过程本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双功能酶生物催化剂，其特征在于：所述双功能酶生物催化剂的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种双功能酶生物催化剂，其特征在于：所述双功能酶生物催化剂的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。


2.如权利要求1所述双功能酶生物催化剂，其特征在于：所述双功能酶生物催化剂为同时具有羰基还原氨化和辅酶再生能力的高效表达双功能酶的重组大肠杆菌全细胞。


3.如权利要求1或2所述双功能酶生物催化剂的制备方法，其特征在于，采用如下步骤：
步骤(1)
用基因重组技术，将编码双功能酶(TLF)的全长基因tlf连接到载体pET28a上，形成质粒pET28a-tlf；
步骤(2)
将步骤(1)形成的质粒pET28a-tlf转入感受态细胞E.coliBL21(DE3)，接种卡拉霉素抗性的Luria-Bertani(LB)液体培养基，放大培养，诱导重组大肠杆菌表达双功能酶TLF，4℃离心收集菌体，用缓冲溶液洗涤，既得。


4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的培养时间为24-72小时。


5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：诱导重组大肠杆菌表达双功能酶的培养温度为16-30℃。


6.如权利要求3所述的方法中，其特征在于：所述的卡拉霉素的浓度为50-200μg/L；所述诱导表达双功能酶TLF的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，浓度为0.4-1.0mM。


7.权利要求1或2所述双功能酶生物催化剂在合成(S)-环丙基甘氨酸中的应用。

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，李珊珊，陈倩，石山，李阳，王鑫，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50