利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法技术

本发明专利技术通过对种毒稀释液进行改良，在磷酸缓冲液的基础上，添加了特定比例的天冬氨酸、ZnCl

【技术实现步骤摘要】
利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法
：本专利技术属于生物
，具体涉及利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法。
技术介绍
：禽流感（AvianInfluenza）是由正粘病毒科甲型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，被OIE定为I类传染病，其是以侵害呼吸系统为主的疾病，常常导致家禽发病甚至死亡，亦可感染哺乳动物和人。2003年以来，高致病性禽流感在我国和世界许多国家广泛流行，给养禽业造成巨大的经济损失，同时，威胁人类的健康。目前对于禽流感的防控，疫苗免疫接种是最主要的预防手段。在禽流感疫苗生产中，目前主要依靠鸡胚法，通常采用SPF鸡胚或者非免鸡胚进行培养，但是SPF鸡饲养条件苛刻，SPF鸡胚成本相对较高，非免疫鸡需要养殖场所处位于非疫区，且不能采用疫苗免疫，常规的养殖场所难以达到非免疫的要求。王志方等人研究表明，禽流感病毒可以在含有一定量母源抗体的低免鸡胚中进行培养。
技术实现思路
：本专利技术针对现有技术中H7亚型禽流感病毒灭活疫苗主要依赖SPF鸡胚或者非免鸡胚，其生产成本高的问题，旨在提供一种利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法。为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种利用低免鸡胚培养H7亚型禽流感病毒的方法，所述方法是将H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后接种于低免鸡胚，接种后置36～37℃继续孵育72-96小时，收获活胚的鸡胚液，经离心、浓缩后得到H7亚型禽流感病毒原液，其特征在于，所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液。本专利技术还请求保护一种利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法，包括利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒原液，经灭活后，向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H7亚型禽流感病毒灭活疫苗，所述利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒原液的方法，所述方法是将H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后接种于低免鸡胚，接种后置36～37℃继续孵育72-96小时，收获活胚的鸡胚液，经离心、浓缩后得到H7亚型禽流感病毒原液，其特征在于，所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液。所述磷酸盐缓冲液按照如下方法配制：取NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4﹒12H2O2.9g，KH2PO40.2g，将以上试剂依次溶解于800mL双蒸馏水中，边加边搅拌使其溶解，然后用NaOH或HCl调节至pH7.4，最后加双蒸水至1000mL，灭菌备用。所述种毒稀释液中天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl2的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL。所述种毒稀释液采用如下方法制备得到：按照天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl2的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL的浓度将天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子与磷酸盐缓冲液混合，采用0.22μm的滤器过滤除菌，4℃下保存，备用。所述H7亚型禽流感病毒优选为H7N9亚型H7-Re2株，由中国农业科学哈尔滨兽医研究所鉴定、保管和供应，本公司被授权生产。所述表皮生长因子为重组人表皮生长因子（rhEGF），购自武汉艾美捷科技有限公司，产品货号为PRP100159。所述低免鸡胚中母源抗体含量≤3log2。本专利技术还请求保护一种利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤一，取H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液作10倍系列稀释，取10-4稀释度的病毒液，尿囊腔内接种10～11日龄低免鸡胚，每胚0.1ml，接种后置36～37℃继续孵育，不必翻蛋；步骤二，鸡胚接种后，每日照蛋2次，将在24小时前死亡的鸡胚弃去，24小时以后死亡的鸡胚随时取出，至72小时，将活胚全部取出，气室向上直立，置于2～8℃冷库冷却12～24小时。步骤三，将冷却12～24小时的鸡胚取出，表面消毒后，将其推入收获操作间，采用全自动收获机对活胚吸取鸡胚液，每若干个鸡胚的胚液混合为一组，在收获胚液的同时，应逐个检查鸡胚，如胎儿腐败、胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用；步骤四，收获后的胚液置于灭菌瓶中，每组抽样测定血凝价，血凝价应不低于1:256，并逐瓶抽样2～3ml留样，收获的胚液灭活前置2~8℃保存，应不超过3日；步骤五，将检验合格的鸡胚液通过离心机离心后，混合于一个浓缩罐内，在无菌条件下用灭菌的二级预过滤柱滤过，除去病毒液的残渣和其他杂质，再用超滤浓缩装置，将病毒液连续循环，水分不断渗去，浓缩至原体积的1/3，完成病毒浓缩过程，同时取样测定毒价，其HA效价不低于1：512；步骤六，采用甲醛灭活，准确量取甲醛，用注射用水配制成10%的甲醛溶液，混合均匀，然后往鸡胚液加入甲醛溶液，随加随搅拌，使其充分混合，按抗原量计，使甲醛最终浓度为0.2%，甲醛加入完毕后，启动浓缩罐升温系统，抗原温度达到37℃时，将抗原倒到另一个已灭菌的灭活罐内开始计时，灭活24小时，期间不停搅拌。至灭活24小时，取样做无菌检验和灭活检验；步骤七，向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H7亚型禽流感病毒灭活疫苗。基于以上技术方案，本专利技术具有如下优点和有益效果：本专利技术通过对种毒稀释液进行调整和优化，以磷酸缓冲液为基础，通过添加天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子，实现了H7亚型禽流感病毒在低免鸡胚中的高效增殖，采用所述方法制备得到的疫苗，其病毒含量、HA效价以及免疫后HI抗体水平均达到非免鸡胚同样的生产水平，而低免鸡胚的价格低于非免鸡胚和SPF鸡胚，该项技术的推广能够帮助企业降低生产成本，且能在一定程度上减少低免或非免鸡胚原料产量限制对于生产的约束。另外，在本专利技术的种毒稀释液中首次添加了ZnCl2和表皮生长因子，试验表明，两者的配合试验能够提高低免鸡胚接种后的活胚数量，减少鸡胚的死亡，另外，单胚尿囊液的收获量、病毒含量相比磷酸缓冲液作为种毒稀释液得到了很大的提高，病毒含量相比提高了约12倍，活胚数提高了9.1%，平均单枚活胚收获量提高了12.01%，其极大地提高了生产产出和生产效率。并且，单独提高ZnCl2或表皮生长因子水平，其相应的技术效果相应下降，也就是说，仅有在本专利技术限定的ZnCl2的浓度为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL的情况下，才能取得最佳的培养结果。以上试验表明，在该种毒稀释液中，ZnCl2和表皮生长因子在特定浓度比例下发挥了相互协同的作用，不仅能够提高活胚比例，减少死胚的发生，而且其也能促进尿囊液的增加以及尿囊液中病毒的增殖。综上所述，本专利技术通过对种毒稀释液进行改良，在磷酸缓冲液的基础上，添加了特定比例的天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子，实现了低免鸡胚中H7亚型禽流感病毒的高效增殖，其病毒增殖水平和制备的疫苗的免疫效果与SPF鸡胚、非免鸡胚生产疫苗的水平基本接近，然而有效的降低了生产成本，降低了生产门槛，对于H7亚型禽流感疫苗的生产具有积极的意义。具体实施方式：...

【技术保护点】
1.一种利用低免鸡胚培养H7亚型禽流感病毒的方法，所述方法是将H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后接种于低免鸡胚，接种后置36～37℃继续孵育72-96小时，收获活胚的鸡胚液，经离心、浓缩后得到H7亚型禽流感病毒原液，其特征在于，所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、ZnCl

【技术特征摘要】
1.一种利用低免鸡胚培养H7亚型禽流感病毒的方法，所述方法是将H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后接种于低免鸡胚，接种后置36～37℃继续孵育72-96小时，收获活胚的鸡胚液，经离心、浓缩后得到H7亚型禽流感病毒原液，其特征在于，所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液。


2.一种利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的方法，包括利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒原液，经灭活后，向灭活的病毒液中加矿物油佐剂混合乳化制成H7亚型禽流感病毒灭活疫苗，所述利用低免鸡胚生产H7亚型禽流感病毒原液的方法，所述方法是将H7亚型禽流感病毒毒种用种毒稀释液稀释后接种于低免鸡胚，接种后置36～37℃继续孵育72-96小时，收获活胚的鸡胚液，经离心、浓缩后得到H7亚型禽流感病毒原液，其特征在于，所述种毒稀释液是添加了天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子的磷酸盐缓冲液。


3.根据权利要求1或2所述的方法，所述种毒稀释液中天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl2的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液按照如下方法配制：取NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HPO4﹒12H2O2.9g，KH2PO40.2g，将以上试剂依次溶解于800mL双蒸馏水中，边加边搅拌使其溶解，然后用NaOH或HCl调节至pH7.4，最后加双蒸水至1000mL，灭菌备用。


5.根据权利要求3或4所述的方法，所述种毒稀释液采用如下方法制备得到：按照天冬氨酸的浓度为1.5mg/mL，ZnCl2的质量百分比为0.05mg/mL，表皮生长因子浓度为1ng/mL的浓度将天冬氨酸、ZnCl2和表皮生长因子与磷酸盐缓冲液混合，采用0.22μm的滤器过滤除菌，4℃下保存，备用。


6.根据权利要求1或2所述的方法，所述H7亚型禽流感病毒优选为H7N9亚型H7-Re2株。

【专利技术属性】
技术研发人员：杨傲冰，陈坚，史大庆，穆光慧，胡美容，王千菊，郑铁锁，侯高伟，孙彩宜，陈金仙，
申请(专利权)人：广东永顺生物制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44