一种将尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法技术

本发明专利技术提供了一种将尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，所述方法包括：将表达四个转录因子和miRNA的载体导入尿液细胞中，包裹到多肽水凝胶中之后再置于细胞培养基中培养；所述转录因子包括OCT4、SOX2、SV40LT和KLF4；所述miRNA包括miRNA302和miRNA367。本发明专利技术利用三维多肽水凝胶替代传统的Matrigel，将表达转录因子和miRNA的尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞，避免了使用动物源性的Matrigel，尿液细胞均一培养分布于多肽水凝胶中，不贴壁培养，有利于实现自动化吸取细胞克隆，质量可控、成分安全，扩大了诱导性多能干细胞的临床应用范围。

【技术实现步骤摘要】
一种将尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法
本专利技术属于体细胞重编程
，涉及一种将尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法。
技术介绍
人的多种体细胞包括尿液细胞可以通过导入转录因子OCT4、SOX2、SV40LT、KLF4和micro-RNA的方式被重编程为诱导性多能干细胞(iPSCs)(Xue,Y.；Cai,X.；Wang,L.；Liao,B.；Zhang,H.；Shan,Y.；Chen,Q.；Zhou,T.；Li,X.；Hou,J.；Chen,S.；Luo,R.；Qin,D.；Pei,D.；Pan,G.,Generatinganon-integratinghumaninducedpluripotentstemcellbankfromurine-derivedcells.PLoSOne2013,8(8),e70573.)。但是，目前的重编程技术是将尿液细胞置于二维Matrigel包被的培养板中进行重编程的。Matrigel是从EHSEngelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤中得到的可溶性基底膜抽提物，含有不可靠的动物来源成分，且存在难以控制的批次效应，临床应用于重编程诱导性多能干细胞存在诸多问题。因此，有必要找到一种成分确定、非动物源性来源的尿液细胞重编程环境，更好地制备诱导性多能干细胞并应用于临床。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种将尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，利用三维多肽水凝胶替代传统的Matrigel，将尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞，避免了使用动物源性的Matrigel，扩大了诱导性多能干细胞的临床应用范围。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种将尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，所述方法包括：将表达转录因子和miRNA的尿液细胞包裹于多肽水凝胶中，置于细胞培养基中培养；所述转录因子包括OCT4、SOX2、SV40LT和KLF4；所述miRNA包括miR302和miR367。本专利技术中，将表达转录因子OCT4、SOX2、SV40LT、KLF4和miR302、miR367的尿液细胞培养于非动物性来源的含有16个氨基酸的多肽水凝胶中进行重编程，将尿液细胞高效诱导为多能性干细胞，替代了动物源性的Matrigel，得到的多能性干细胞质量可控、成分安全，有利于应用于临床。本专利技术的三维多肽水凝胶不含有细胞外基质成分，能够抑制尿液细胞膜上integrinβ1(ITGB1)的表达，从而降低了focaladhesionkinase(FAK)的磷酸化，显著提高了可诱导多能干细胞的效率，且尿液细胞均匀分散于多肽水凝胶中、均一性好，不贴壁培养，有利于实现自动化吸取细胞克隆。优选地，所述尿液细胞通过电转质粒的方式表达OCT4、SOX2、SV40LT、KLF4、miR302和miR367。优选地，所述多肽水凝胶包括精氨酸、丙氨酸或天冬氨酸中的任意一种或至少两种的组合，优选为精氨酸、丙氨酸和天冬氨酸的组合。优选地，所述多肽水凝胶包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；SEQIDNO:1：RARADADARARADADA。优选地，所述尿液细胞在所述多肽水凝胶的浓度为1×105～1×106/mL，即1×105～1×106个尿液细胞包裹于1mL多肽水凝胶中。优选地，所述培养基包括人多能干细胞培养基，优选为mTesr培养基。优选地，所述mTesr培养基含有抑制剂。优选地，所述抑制剂包括A8301、PD032590、CHIR99021或thiazovivin中的任意一种或至少两种的组合，优选为A8301、PD032590、CHIR99021和thiazovivin的组合。优选地，所述培养基包括含有0.1～1μMA8301、0.1～1μMPD032590、1～5μMCHIR99021和0.1～1μMthiazovivin的mTesr培养基，和不含抑制剂的mTesr培养基。优选地，所述培养的温度为35～38℃，例如可以是35℃、36℃、37℃或38℃，优选为37℃。优选地，所述培养的CO2浓度为3％～6％，例如可以是3％、4％、5％或6％，优选为5％。优选地，所述培养的时间为15～25天，例如可以是15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天，优选为20天。优选地，所述尿液细胞包裹于多肽水凝胶中后，置于含有0.1～1μMA8301、0.1～1μMPD032590、1～5μMCHIR99021和0.1～1μMthiazovivin的mTesr培养基培养8～12天，随后更换培养基为mTesr培养基继续培养8～12天。作为优选技术方案，所述将尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，包括以下步骤：(1)将OCT4、SOX2、SV40LT、KLF4重组质粒和miR302、miR367重组质粒电转导入尿液细胞；(2)将电转后的尿液细胞重悬到氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的多肽水凝胶溶液中，加入尿液培养基瞬间成胶，置于35～38℃、3％～6％CO2中培养形成三维半固体水凝胶；(3)更换培养基为含有0.1～1μMA8301、0.1～1μMPD032590、1～5μMCHIR99021和0.1～1μMthiazovivin的mTesr培养基培养8～12天，随后更换培养基为mTesr培养基继续培养8～12天，得到所述诱导性多能干细胞。第二方面，本专利技术提供了一种诱导性多能干细胞，所述诱导性多能干细胞由第一方面所述的方法制备得到。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：(1)本专利技术采用成分确定的非动物来源的多肽水凝胶代替Matrigel用于尿液细胞的重编程，三维多肽水凝胶不含有细胞外基质成分，抑制了尿液细胞膜上integrinβ1(ITGB1)的表达，降低了focaladhesionkinase(FAK)的磷酸化，将尿液细胞高效诱导为多能性干细胞；(2)本专利技术采用三维多肽水凝胶培养尿液细胞，尿液细胞均匀分散于多肽水凝胶中、均一性好，不贴壁培养，有利于实现自动化吸取细胞克隆；(3)本专利技术的三维多肽水凝胶成分简单、可靠，培养得到的多能性干细胞质量可控、成分安全，具有广泛的临床应用前景。附图说明图1为尿液细胞在二维Matrigel和在三维多肽水凝胶中的重编程过程；图2为碱性磷酸酶染色鉴定的二维Matrigel和三维多肽水凝胶中的克隆；图3为免疫荧光染色鉴定内源多能干性基因(Oct4、Sox2、SSEA4、TRA-1-60)在二维Matrigel和三维多肽水凝胶中克隆中的表达；图4A为Oct4、DPPA4在所有克隆中和单克隆中的表达情况，图4B为2DMatriel和3D-PM中克隆的相关性统计，图4C为胚胎干细胞多能性相关基因在2DMatriel和3D-PM中克隆的表达谱，图4D为在2DMa本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种将尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将表达转录因子和miRNA的尿液细胞包裹于多肽水凝胶中，置于细胞培养基中培养；/n所述转录因子包括OCT4、SOX2、SV40LT和KLF4；/n所述miRNA包括miR302和miR367。/n

【技术特征摘要】
1.一种将尿液细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将表达转录因子和miRNA的尿液细胞包裹于多肽水凝胶中，置于细胞培养基中培养；
所述转录因子包括OCT4、SOX2、SV40LT和KLF4；
所述miRNA包括miR302和miR367。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述尿液细胞通过电转质粒的方式表达OCT4、SOX2、SV40LT、KLF4、miR302和miR367。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多肽水凝胶包括精氨酸、丙氨酸或天冬氨酸中的任意一种或至少两种的组合，优选为精氨酸、丙氨酸和天冬氨酸的组合；
优选地，所述多肽水凝胶包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。


4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述尿液细胞在所述多肽水凝胶的浓度为1×105～1×106/mL。


5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述培养基包括人多能干细胞培养基，优选为mTesr培养基；
优选地，所述mTesr培养基含有抑制剂；
优选地，所述抑制剂包括A8301、PD032590、CHIR99021或thiazovivin中的任意一种或至少两种的组合，优选为A8301、PD032590、CHIR99021和thiazovivin的组合；
优选地，所述培养基包括含有0.1～1μMA8301、0.1～1μMPD032590、1～5μMCHIR99021和0.1～1μMthiazovivin的mTesr培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：张骁，孙薇，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44