一种双基因修饰的干细胞及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种双基因修饰的干细胞及其制备方法和用途，还提供了包括该干细胞的药物组合物。其中，所述干细胞包括位于相同表达载体中的第一外源核酸和第二外源核酸，第一外源核酸编码包括第一蛋白的核苷酸序列，第一蛋白选自脂联素、脂联素变体或包含所述脂联素或脂联素变体的第一融合蛋白；第二外源核酸编码包括第二蛋白的核苷酸序列，第二蛋白选自鞘氨醇激酶1、鞘氨醇激酶1变体或包含所述鞘氨醇激酶1或鞘氨醇激酶1变体的第二融合蛋白。本发明专利技术提供的双基因修饰的干细胞，展现出Adiponectin基因和突变的SPHK1基因的协同效应，能够显著降低受试动物的血糖、血脂，减轻体重。

【技术实现步骤摘要】
一种双基因修饰的干细胞及其用途
本专利技术属于细胞治疗
，具体涉及治疗糖尿病的干细胞，尤其涉及一种经脂联素(Adiponectin)和突变的鞘氨醇激酶1(sphingosinekinase1，SPHK1)基因共同修饰的干细胞及其用途。
技术介绍
肥胖与2型糖尿病(T2DM)是困扰现代社会的主要公共健康问题之一。肥胖及其伴随的胰岛素抵抗是2型糖尿病发病的关键因素，据调查，80-90％的2型糖尿病患者超重或肥胖。因此，有效控制血糖和体重始终是有关研究领域的焦点课题。据统计，目前全球2型糖尿病的发病人群已经达到4亿，占所有糖尿病患者的90％-95％。内源性的激素、细胞因子或酶类的分泌不足、活性降低或功能缺陷与代谢病的发生密切相关，如胰岛素抵抗和相对分泌不足是导致糖尿病的核心原因。因此，这些糖脂代谢平衡调控的关键分子也是治疗糖尿病等代谢综合征药物开发的重点对象。脂联素(Adiponectin)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，其作为一种胰岛素增敏激素，能改善小鼠的胰岛素抗性和动脉硬化症。对人体的研究发现，脂联素水平能预示II型糖尿病和冠心病的发展，并在临床试验表现出抗糖尿病、抗动脉粥样和炎症的潜力。脂联素作为一种胰岛素超敏化激素，还可以增加促进骨骼肌细胞的脂肪酸氧化和糖吸收，明显加强胰岛素的抑制糖原异生作用，抑制肝脏的糖生成，是机体的脂质代谢和血糖稳态的调控网络中的重要调节因子。在实验性动脉粥样硬化模型中，血浆脂联素水平与甘油三酯和低密度脂蛋白成负相关关系，与高密度脂蛋白成正相关关系。给予脂联素治疗，能明显降低血液甘油三酯和低密度脂蛋白含量，增加高密度脂蛋白含量，减轻动脉粥样硬化病变。越来越多的证据表明，脂联素及其人工合成体在治疗2型糖尿病和与胰岛素抵抗有关的代谢综合征方面有一定的价值。最近研究报道体内迅速给予切去顶端的脂联素，会降低高脂饮食小鼠的餐后血浆游离脂肪酸，如果缓慢给予这种蛋白，会引起小鼠体重持续降低而不影响其食物吸收。Scherer和他的助手也证实迅速注射重组脂联素，将会完全改善几种糖尿病动物模型体内的高血糖症，包括ob/ob小鼠、非肥胖糖尿病小鼠和经链脲霉素治疗的小鼠。鞘氨醇激酶1(SphK1)是新近发现的脂质激酶家族，从进化上讲，在人、小鼠、酵母和植物中是保守的，该酶属于鞘脂代谢途径中的一种关键酶，催化鞘氨醇形成鞘氨醇-1-磷酸(S1P)，是调控神经酰胺和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)合成的“变阻器”。S1P与受体结合后可调控细胞生长、凋亡、分化、造血等细胞过程。SphK1/S1P信号通路参与了多种生物学过程和疾病的发生，包括肿瘤发生和糖尿病。此外，糖尿病小鼠在注射了带有人SphK1基因的腺病毒之后，与对照小鼠相比显示了降低的血糖和血脂水平。目前对SphK1的研究主要是基于其在细胞内的作用，以该蛋白为靶点开发的药物主要是使用其抗体或拮抗体，并没有直接将该蛋白制成药物进行治疗；另一种是以病毒等为载体，将SPHK1基因导入到细胞进行基因治疗，例如用腺病毒作为载体的基因治疗，但是该种方法容易在体内产生抗药性，而治疗糖尿病等代谢性疾病需要长期用药，故限制了该方法的使用。因此，亟需开发一种全新的、能够从根本上显著治疗糖脂代谢性疾病的方法。
技术实现思路
为了克服上述问题，本专利技术人进行了锐意研究，结果发现：采用Adiponectin基因和突变的SPHK1基因同时修饰的间充质干细胞，能够显著降低受试动物的血糖、血脂，减轻体重，且可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应，为代谢性疾病的治疗提供了重要的研究依据，从而完成了本专利技术。具体来说，本专利技术的目的在于提供以下方面：本专利技术的第一方面，提供了一种双基因修饰的干细胞，所述干细胞包括第一外源核酸和第二外源核酸，所述第一外源核酸包括编码第一蛋白的核苷酸序列，所述第二外源核酸包括编码第二蛋白的核苷酸序列，其中，所述第一蛋白选自脂联素、脂联素变体或包含所述脂联素或脂联素变体的第一融合蛋白，所述第二蛋白选自鞘氨醇激酶1、鞘氨醇激酶1变体或包含所述鞘氨醇激酶1或鞘氨醇激酶1变体的第二融合蛋白。其中，所述第一蛋白具有如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；所述第二蛋白具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。其中，所述细胞还包括表达载体，所述第一外源核酸和第二外源核酸包含于相同或不同的表达载体中，优选包含于相同的表达载体中。其中，所述双基因修饰的干细胞通过将第一外源核酸和第二外源核酸导入间充质干细胞获得。第二方面，提供了一种双基因修饰的干细胞的制备方法，优选用于制备上述的干细胞，其中，所述制备方法包括将第一外源核酸和第二外源核酸连接，并导入间充质干细胞的步骤。其中，所述制备方法包括以下步骤：步骤1，获得第一外源核酸和第二外源核酸，酶切后与载体质粒连接，得到重组质粒；步骤2，将重组质粒与包装质粒进行慢病毒包装细胞的转染，得到含有第一外源核酸和第二外源核酸的重组慢病毒载体；步骤3，将上述获得的重组慢病毒载体转染至间充质干细胞，得到双基因修饰的干细胞。第三方面，提供了一种上述方法制备得到的双基因修饰的干细胞。第四方面，提供了一种上述的干细胞或上述方法制备得到的双基因修饰的干细胞在制备治疗代谢疾病药物中的应用。其中，所述代谢疾病选自肥胖、I型糖尿病、II型糖尿病、血脂异常、胰岛素耐受、高血糖、代谢综合征、动脉粥样硬化、冠心病，以及上述疾病的继发性并发症。第五方面，提供了一种药物组合物，其中，所述组合物包括上述的干细胞或上述方法制备得到的双基因修饰的干细胞。本专利技术所具有的有益效果包括：(1)本专利技术提供的双基因修饰的干细胞，能够同时表达脂联素和鞘氨醇激酶1，展现出Adiponectin基因和突变的SPHK1基因的协同效应，能够显著降低受试动物的血糖、血脂，减轻体重；(2)本专利技术提供的双基因修饰的干细胞，既保持间充质干细胞的功能，又能很好的表达脂联素和鞘氨醇激酶1蛋白，可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应；(3)本专利技术提供的双基因修饰的干细胞，具备显著提高的降低血糖、血脂等生物学活性，能够有效用于制备治疗代谢疾病的药物，具有重大的临床价值。附图说明图1示出根据本专利技术一种优选实施方式的pCDH-AQS基因质粒图谱；图2示出实验例1中Realtime-PCR检测的Adiponectin和QSPHK1表达量的结果图；图3示出实验例1中ELISA检测的Adiponectin和QSPHK1表达量的结果图；图4示出实验例2中各样品对固醇代谢基因SREBP1cmRNA表达水平的影响的检测结果；图5示出实验例2中各样品对固醇代谢基因SREBP1和SREBP2蛋白水平的影响的检测结果；图6示出实验例3中各样品对脂代谢调控基因p-AMPK和AMPK表达水平的影响的检测结果；图7为糖尿病模型鼠随机体重改变趋势图，箭头代表给予药物和细胞的时间点；图8为糖尿病模型鼠空腹血糖改变趋势图，箭头代表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双基因修饰的干细胞，其特征在于，所述干细胞包括第一外源核酸和第二外源核酸，所述第一外源核酸包括编码第一蛋白的核苷酸序列，所述第二外源核酸包括编码第二蛋白的核苷酸序列，其中，/n所述第一蛋白选自脂联素、脂联素变体或包含所述脂联素或脂联素变体的第一融合蛋白，/n所述第二蛋白选自鞘氨醇激酶1、鞘氨醇激酶1变体或包含所述鞘氨醇激酶1或鞘氨醇激酶1变体的第二融合蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种双基因修饰的干细胞，其特征在于，所述干细胞包括第一外源核酸和第二外源核酸，所述第一外源核酸包括编码第一蛋白的核苷酸序列，所述第二外源核酸包括编码第二蛋白的核苷酸序列，其中，
所述第一蛋白选自脂联素、脂联素变体或包含所述脂联素或脂联素变体的第一融合蛋白，
所述第二蛋白选自鞘氨醇激酶1、鞘氨醇激酶1变体或包含所述鞘氨醇激酶1或鞘氨醇激酶1变体的第二融合蛋白。


2.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，所述第一蛋白具有如SEQIDNO：1所示的氨基酸序列；
所述第二蛋白具有如SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。


3.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，所述细胞还包括表达载体，所述第一外源核酸和第二外源核酸包含于相同或不同的表达载体中，
优选包含于相同的表达载体中。


4.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，所述双基因修饰的干细胞通过将第一外源核酸和第二外源核酸导入间充质干细胞获得。


5.一种双基因修饰的干细胞的制备方法，优选用于制备权利要求1至4之一所述的干细胞，其特征在于，所述制备方法包括将...

【专利技术属性】
技术研发人员：段海峰，薛冰华，于婷婷，解晶，庞如梦，刘丽华，
申请(专利权)人：北京双因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11