一种C1orf70小体的制备及分离纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种C1orf70小体的制备及分离纯化方法。本发明专利技术人发现在真核生物细胞中过表达外源性C1orf70基因，C1orf70在细胞(如293Ta)中会组装成C1orf70小体。通过体外扩增含有C1orf70小体的293Ta细胞，C1orf70小体可以大量获得，并且通过研磨破碎细胞，差速离心分离细胞组分，滤膜过滤的方法，可以对C1orf70小体进行分离、纯化。本发明专利技术的提出对于研究C1orf70小体的内部结构，及其组装机制，并进一步了解C1orf70在SCA21疾病中的相关作用方式具有重要意义，具有潜在的临床应用价值。同时对于以SCA21疾病为代表的跨膜蛋白异常疾病也具有重要的参考意义。

【技术实现步骤摘要】
一种C1orf70小体的制备及分离纯化方法
本专利技术涉及一种C1orf70小体的制备及分离纯化方法。本专利技术属于生物工程

技术介绍
第1号染色体开放读码框70(Chromosome1OpenReadingFrame70，C1orf70)也称作跨膜蛋白C1orf70(TransmembraneProteinC1orf70)，脊髓小脑共济失调21(SpinocerebellarAtaxia21，SCA21)或跨膜蛋白240(TransmembraneProtein240，TMEM240)。C1orf70是在中枢神经系统中发现的编码含有两个跨膜结构域蛋白质的基因，人类C1orf70基因位于1号染色体短臂36.33处，基因序列长1128bp，可编码区长522bp，编码由173个氨基酸组成的蛋白质，其分子量约为20KD[J.Delplanque,D.Devos,V.Huin,A.Genet,O.Sand,C.Moreau,C.Goizet,P.Charles,M.Anheim,M.L.Monin,L.Buee,A.Destee,G.Grolez,C.Delmaire,K.Dujardin,D.Dellacherie,A.Brice,G.Stevanin,I.Strubi-Vuillaume,A.Durr,B.Sablonniere,TMEM240mutationscausespinocerebellarataxia21withmentalretardationandseverecognitiveimpairment,Brain:ajournalofneurology137(Pt10)(2014)2657-63.]。小鼠C1orf70基因位于4号染色体，基因序列全长1378bp，同样编码由173个氨基酸组成的蛋白质。人源C1orf70和鼠源C1orf70蛋白质序列运用Pubmed的BLAST功能(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查询发现一致性达97.69％。C1orf70编码的蛋白是一个含有2个跨膜结构的跨膜蛋白，且具有一定的疏水特性。现有的研究认为脊髓小脑共济失调病21与C1orf70基因的突变有关。该疾病是一种常染色体显性遗传的神经系统退行性疾病，主要引起患者的智力迟钝和认知功能丧失，病情严重患者还伴有以进行性小脑共济失调为特征的功能障碍症状，其病变部位主要发生在脊髓和小脑。在该疾病中C1orf70发生了(c.509C4T/p.P170L)的突变[J.M.Ward,A.R.LaSpada,IdentificationoftheSCA21diseasegene:remainingchallengesandpromisingopportunities,Brain:ajournalofneurology137(Pt10)(2014)2626-8.]。在研究中，我们原创性的发现在体外培养的细胞中过表达外源性的C1orf70基因可以在细胞内形成一种特殊的多层囊泡样结构-C1orf70小体，其形状为球型或椭球形，长轴直径约为0.2-2μm，结构相对稳定，反复冻融后不易分解，可在-80℃条件下稳定保存。研究清楚C1orf70小体的内部结构，及其组装机制将对于了解C1orf70在SCA21疾病中的相关作用方式具有重要意义，具有潜在的临床应用价值。同时对于以SCA21疾病为代表的跨膜蛋白异常疾病也具有重要的参考意义。有鉴于此，本专利技术首次对C1orf70小体进行了系统的分离、纯化，并提供了一种可以稳定获得C1orf70小体的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种C1orf70小体的制备及分离纯化方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术提出的一种C1orf70小体的制备及分离纯化方法，包括以下步骤：(1)在293Ta细胞中过表达C1orf70基因，使293Ta细胞带有C1orf70小体；(2)对C1orf70过表达的293Ta进行抗生素筛选，并获得稳定克隆，得到纯化的C1orf70过表达的293Ta细胞系；(3)用细胞刮刀收集C1orf70过表达的293Ta细胞；(4)用玻璃研磨器对C1orf70过表达的293Ta细胞进行细胞破碎；(5)通过吹打使C1orf70小体与细胞其它组分分开；(6)通过低速离心使C1orf70小体与细胞核、细胞碎片以及其它大块组织分离；(7)通过中速离心使C1orf70小体与比重轻的细胞器分离；(8)通过滤膜过滤进一步纯化C1orf70小体；(9)高速离心获得纯化的C1orf70小体。其中，优选的，步骤(1)所述的在293Ta细胞中过表达C1orf70基因，使293Ta细胞带有C1orf70小体通过以下步骤实现：设计用于扩增C1orf70基因的引物，以人神经组织cDNA为模板为PCR模板，对人源C1orf70基因进行扩增，所述的引物序列如下所示：上游引物hC1orf70-F：AAACTCGAGACCATGTCCATGAGTGCGAAC下游引物hC1orf70-R：AAAGCGGCCGCTTACAGGTGCCGCGGGCTG对PCR产物和质粒载体pLVX-AcGFP-N1分别进行XhoI和NotI酶切，用T4连接酶将经过XhoI和NotI酶切后的PCR产物连接入酶切后的pLVX-AcGFP-N1骨架载体中，获得pLVX-C1orf70-ΔAcGFP-N1质粒，其中所含有的C1orf70的基因序列如SEQIDNO.1所示；用脂质体将质粒pLVX-C1orf70-ΔAcGFP-N1和包装质粒psPAX2，pMD2.G共同转入293Ta细胞中，使293Ta细胞生成带有C1orf70基因的慢病毒颗粒；其中，优选的，质粒pLVX-C1orf70-ΔAcGFP-N1和包装质粒psPAX2，pMD2.G的摩尔比为1：1：1。其中，优选的，步骤(2)中，所述的抗生素筛选是将带有C1orf70小体的293Ta细胞用1μg/ml的嘌呤霉素筛选，4天后获得高纯度的含有C1orf70小体的293Ta细胞；然后将含有C1orf70小体的293Ta细胞在0.5μg/ml的嘌呤霉素维持液中进行极低密度接种96孔板，即初始孔细胞浓度为50-60细胞/ml，后续孔依次倍比稀释，7天后选择含有单个细胞团的孔继续培养；将选取的孔中的细胞进行扩增，20天后可获得带有C1orf70小体的稳定293Ta细胞系。其中，优选的，步骤(3)中，是用细胞刮刀将带有C1orf70小体的293Ta细胞从培养瓶中刮下，用PBS进行重悬，700g，10min离心收集细胞团块。其中，优选的，步骤(4)中，是用PBS调整细胞浓度为107细胞/ml，每次200μl加入玻璃研磨器，反复研磨使细胞破碎。其中，优选的，步骤(5)中，所述的吹打是指用微量移液器枪头反复吹打研磨后的液体，使C1orf70小体与细胞其它组分分开。其中，优本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种C1orf70小体的制备及分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)在293Ta细胞中过表达C1orf70基因，使293Ta细胞带有C1orf70小体；/n(2)对C1orf70过表达的293Ta进行抗生素筛选，并获得稳定克隆，得到纯化的C1orf70过表达的293Ta细胞系；/n(3)用细胞刮刀收集C1orf70过表达的293Ta细胞；/n(4)用玻璃研磨器对C1orf70过表达的293Ta细胞进行细胞破碎；/n(5)通过吹打使C1orf70小体与细胞其它组分分开；/n(6)通过低速离心使C1orf70小体与细胞核、细胞碎片以及其它大块组织分离；/n(7)通过中速离心使C1orf70小体与比重轻的细胞器分离；/n(8)通过滤膜过滤进一步纯化C1orf70小体；/n(9)高速离心获得纯化的C1orf70小体。/n

【技术特征摘要】
1.一种C1orf70小体的制备及分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在293Ta细胞中过表达C1orf70基因，使293Ta细胞带有C1orf70小体；
(2)对C1orf70过表达的293Ta进行抗生素筛选，并获得稳定克隆，得到纯化的C1orf70过表达的293Ta细胞系；
(3)用细胞刮刀收集C1orf70过表达的293Ta细胞；
(4)用玻璃研磨器对C1orf70过表达的293Ta细胞进行细胞破碎；
(5)通过吹打使C1orf70小体与细胞其它组分分开；
(6)通过低速离心使C1orf70小体与细胞核、细胞碎片以及其它大块组织分离；
(7)通过中速离心使C1orf70小体与比重轻的细胞器分离；
(8)通过滤膜过滤进一步纯化C1orf70小体；
(9)高速离心获得纯化的C1orf70小体。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的在293Ta细胞中过表达C1orf70基因，使293Ta细胞带有C1orf70小体通过以下步骤实现：
设计用于扩增C1orf70基因的引物，以人神经组织cDNA为模板为PCR模板，对人源C1orf70基因进行扩增，所述的引物序列如下所示：
上游引物hC1orf70-F：AAACTCGAGACCATGTCCATGAGTGCGAAC
下游引物hC1orf70-R：AAAGCGGCCGCTTACAGGTGCCGCGGGCTG
对PCR产物和质粒载体pLVX-AcGFP-N1分别进行XhoI和NotI酶切，用T4连接酶将经过XhoI和NotI酶切后的PCR产物连接入酶切后的pLVX-AcGFP-N1骨架载体中，获得pLVX-C1orf70-ΔAcGFP-N1质粒，其中所含有的C1orf70的基因序列如SEQIDNO.1所示；
用脂质体将质粒pLVX-C1orf70-ΔAcGFP-N1和包装质粒psPAX2，pMD2.G共同转入293Ta细胞中，使293Ta细胞生成带有C1orf70基因的慢病毒颗粒；
其中，优选的，质粒pLVX-C1orf70-ΔAcGFP-N1和包装质粒psPAX2，pMD2.G的摩尔比为1：1：1。...

【专利技术属性】
技术研发人员：王菁华，穆莉莉，王广友，孔庆飞，赵崴，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23