Mangicols二倍半萜化合物、合成方法、基因簇、核酸分子、构建体及其应用技术

本发明专利技术公开了一种Mangicols二倍半萜化合物、合成方法、基因簇、核酸分子、构建体及其应用，是针对5个新的mangicols二倍半萜化合物及其生物合成基因簇和药理活性研究，二倍半萜化合物的结构如式I‑V所示。本发明专利技术的mangicols化合物生物合成途径为首次报道。生物合成途径中涉及到的合成酶具有SEQ ID NO：1～7任一项所示的氨基酸序列。同时，本发明专利技术公开了5个mangicols化合物的抗炎活性。本发明专利技术为实现mangicols二倍半萜化合物的高效合成奠定了重要的基础，为该类化合物的获得提供了新的解决方案。

【技术实现步骤摘要】
Mangicols二倍半萜化合物、合成方法、基因簇、核酸分子、构建体及其应用
本专利技术涉及天然产物生物合成
，具体是指一种Mangicols二倍半萜化合物、合成方法、基因簇、核酸分子、构建体及其应用。
技术介绍
萜类化合物是含有异戊二烯单元的化合物的总称。它在自然界中广泛存在，迄今为止，人们从动物、植物以及微生物体内发现的萜类化合物超过8万种。该类化合物具有许多生理活性，被广泛应用于食品、化妆品及医药行业。二倍半萜化合物是一类由5个异戊二烯单元组成核心骨架的萜类化合物的总称，是以较长碳链的香叶基法尼基焦磷酸(GFPP)为底物，经一系列环化、重排等步骤合成的独特复杂的结构，这其中涉及大量新颖的产物合成机理。丝状真菌作为萜类化合物的重要来源，目前对其体内的二倍半萜化合物及其生物合成途径的研究较少，迄今为止仅发现70多种二倍半萜化合物，仅占已知二倍半萜总量的7％，即使如此，丝状真菌来源的二倍半萜化合物已表现出高度复杂的结构多样性，并且其中一些二倍半萜产物具有多种潜在药用价值，如具有多种生物活性的ophiobolin家族化合物、具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的asperterpenolsA和B及具有细胞毒活性的fusaproliferin等，在药物开发中显示出了良好的应用前景。因此，对丝状真菌中蕴藏的具有潜在应用价值的二倍半萜化合物及其生物合成途径进行研究，为该类化合物的高效合成及后续生理学活性评估奠定了重要的基础。
技术实现思路
针对现有技术不足，本专利技术提供一种Mangicols二倍半萜化合物、合成方法、基因簇、核酸分子、构建体及其应用，具体地是涉及了5个新的二倍半萜化合物——mangicols化合物，涉及它们的生物合成基因簇及药理活性，同时涉及生物合成酶、核酸分子、构建体及mangicols二倍半萜化合物的生物合成方法和抗炎活性。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：第一方面，本专利技术提供一种Mangicols二倍半萜化合物，其特征在于：其结构如式I～V所示：第二方面，本专利技术提供一种上述Mangicols二倍半萜化合物的合成方法，其特征在于：包含如下步骤：1)构建异源合成二倍半萜化合物生物合成基因簇的细菌突变株；2)制备细菌突变株AO-mgcDE和AO-mgcCDEF的发酵培养物；3)发酵培养物的萃取、分离及产物纯化；所述细菌为米曲霉、大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、芽孢杆菌、米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、粗糙脉孢菌、交链格孢菌或镰刀菌中任一种。第三方面，本专利技术提供一种二倍半萜产物的制备方法，其特征在于：将AO-mgcDE和AO-mgcCDEF的发酵培养物分别用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩后得到粗提物A和B；粗提物A经反向硅胶柱层析，正己烷-乙酸乙酯体系梯度洗脱，收集正己烷/乙酸乙酯体积比5:1的馏分；将该馏分进行半制备HPLC纯化，以纯乙腈和超纯水为流动相，体积比75:25，90:10洗脱，收集馏分得到如权利要求1中所述式I～III所示的二倍半萜化合物；或者，将粗提物B经反向硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱，收集石油醚/乙酸乙酯体积比20:1的馏分；将该馏分进行氯仿-丙酮体系梯度洗脱，收集氯仿/丙酮体积比15:1的馏分；将该馏分再经HPLC纯化，以乙腈/水体积比45:55作为流动相洗脱，收集馏分得到如权利要求1中所述式IV和式V所示的二倍半萜化合物；所述的二倍半萜化合物是从异源表达宿主细菌的发酵培养物中制备分离得到的；所述细菌为米曲霉、大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、芽孢杆菌、米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、粗糙脉孢菌、交链格孢菌或镰刀菌中任一种。第四方面，本专利技术提供一种二倍半萜生物合成基因簇，其特征在于：如权利要求2中所述构建的细菌突变株含有此异源合成的二倍半萜化合物生物合成基因簇；所述二倍半萜生物合成基因簇含有7个生物合成酶，其具有SEQIDNO：1～7任一项所示的氨基酸序列。第五方面，本专利技术提供一种核酸分子，其特征在于：其编码如权利要求4所述的生物合成酶；所述核酸分子具有SEQIDNO：8～14任一项所示的核苷酸序列。第六方面，本专利技术提供一种构建体，其特征在于：其含有权利要求5所述的核酸分子。第七方面，本专利技术提供一种如上述的Mangicols二倍半萜化合物在制备抗炎药物中的应用。具体来说，本专利技术中的5个mangicols二倍半萜化合物，化合物1～5的结构如式I～V所示，分别命名为mangicolH-L。本专利技术中的二倍半萜化合物的生物合成基因簇，通过异源表达的方法，在米曲霉(Aspergillusoryzae)中表达该生物合成基因簇中的萜类合成酶，构建突变株，从突变株发酵培养物中提取分离得到目标化合物。根据本专利技术的实施例，上述基因簇中含有的萜类合成酶具有SEQIDNO：1～7任一项所示的氨基酸序列。本专利技术中的核酸分子。根据本专利技术的实施例，上述核酸分子编码前面上述的萜类合成酶。由此，根据本专利技术实施例的核酸分子能够有效地编码萜类合成酶，从而催化合成目标化合物。上述核酸分子具有SEQIDNO：8～14所示的核苷酸序列。由此，根据本专利技术实施例的核酸分子能够有效地编码萜类合成酶，从而催化一系列级联反应，以便获得具有后修饰结构的萜类化合物。本专利技术中的构建体。上述构建体含有前面上述核酸分子。由此，根据本专利技术实施例的构建体可以通过表达核酸分子，编码合成萜类合成酶，从而催化合成目标化合物。本专利技术中上述化合物的生物合成途径。上述生物合成途径含有下列至少之一萜类合成酶的参与：萜类合酶(mgcD)、P450酶(mgcE和mgcF)、环氧化合物水解酶(mgcC)。在上述酶的催化作用下，通过两条分支途径合成目标产物。本专利技术中还提出了上述化合物的抗炎活性。上述化合物在细胞水平和小鼠实验模型均表现出抗炎活性。本专利技术的优点及有益效果如下：本专利技术中优选地以米曲霉作为优势表达宿主，通过理性设计，在其体内高效地异源重构了mgc基因簇，并分离鉴定到5个新的且具有抗炎活性的mangicols二倍半萜化合物，为后续该类产物的获得及进一步的深入探究奠定了坚实的基础。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1为本专利技术一个实施例的mangicols化合物生物合成基因簇的生物信息学信息。图2为本专利技术一个实施例的质粒结构示意图。图3为本专利技术一个实施例的米曲霉突变株示意图。图4为本专利技术一个实施例的GC/MS检测图谱。图5为本专利技术一个实施例的HR-LCMS检测图谱。图6为本专利技术一个实施例的化合物(1)的结构示意图；图7为本专利技术化合物(1)1HNMR谱图；图8为本专利技术化合物(1)13CNMR谱图；图9为本专利技术化合物(1)1H-1HCOSY谱图；图10为本专利技术化合物(1)HSQC谱图；图11为本专利技术化合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Mangicols二倍半萜化合物，其特征在于：其结构如式I～V所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种Mangicols二倍半萜化合物，其特征在于：其结构如式I～V所示：





2.一种如权利要求1所述Mangicols二倍半萜化合物的合成方法，其特征在于：包含如下步骤：
1)构建异源合成二倍半萜化合物生物合成基因簇的细菌突变株；
2)制备细菌突变株AO-mgcDE和AO-mgcCDEF的发酵培养物；
3)发酵培养物的萃取、分离及产物纯化；
所述细菌为米曲霉、大肠杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母、芽孢杆菌、米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、粗糙脉孢菌、交链格孢菌或镰刀菌中任一种。


3.一种二倍半萜产物的制备方法，其特征在于：
将AO-mgcDE和AO-mgcCDEF的发酵培养物分别用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，浓缩后得到粗提物A和B；粗提物A经反向硅胶柱层析，正己烷-乙酸乙酯体系梯度洗脱，收集正己烷/乙酸乙酯体积比5:1的馏分；将该馏分进行半制备HPLC纯化，以纯乙腈和超纯水为流动相，体积比75:25，90:10洗脱，收集馏分得到如权利要求1中所述式I～III所示的二倍半萜化合物；或者，
将粗提物B经反向硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯体系梯度...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘天罡，苑玉杰，卞光凯，闫盼，马正宁，陈蓉，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42