在辐射灭菌过程中保护生物活性分子制造技术

本发明专利技术公开了涉及保护生物活性分子的生物活性免于辐射灭菌期间的辐射损害的组合物和方法，所述生物活性分子包括生物活性蛋白或生物反应调节剂，例如免疫反应调节剂。在喷雾干燥到免疫测定管的表面上的过程中，在示例性促有丝分裂凝集素制剂中包含至少一种辐射防护剂化合物(例如，半胱氨酸，还原型谷胱甘肽，褪黑素和/或组氨酸)，令人惊讶地保护了该凝集素的生物(促有丝分裂)活性免于由于电子束辐射灭菌而导致的损失。辐射防护剂化合物还可以保护其他生物活性分子并稳定其生物活性，从而使它们在辐射处理后的长时间保存后仍具有生物活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在辐射灭菌过程中保护生物活性分子
技术介绍

本实施方案总体上涉及体外生物学测定。更具体地，本公开涉及保存、保护和/或恢复和/或稳定生物活性分子的生物活性的组合物和方法，所述生物活性分子包括但不限于生物活性蛋白和/或生物反应调节剂，例如免疫反应调节剂，否则其活性在辐射灭菌期间和/或之后会受到损害和/或减弱。相关领域描述用于从患者获得的生物样品中存在的细胞(例如免疫系统细胞，例如，淋巴细胞，单核细胞，巨噬细胞，树突状细胞或免疫系统其他细胞)的免疫活性的体外测定是本领域众所周知的诊断方法和预后目的。例如，可以通过多种测量方法体外测试从此类样品分离的全血样品或白细胞，以评估免疫反应能力，例如细胞增殖，可溶性介体释放和/或响应丝裂原、特异性抗原或病原体相关分子模式(PAMP)、受体和其他激动剂的刺激的活化。丝裂原包括已知刺激细胞有丝分裂的蛋白质，并用作免疫试剂以非抗原特异性方式诱导淋巴细胞增殖。淋巴细胞丝裂原可以是刺激淋巴细胞增殖和/或释放/分泌可溶性介体的多克隆激活剂，并且可以通过利用非抗原刺激驱动的淋巴细胞分子机制而绕过抗原特异性受体(免疫球蛋白(Ig)或T-细胞受体(TCR))引发强烈的多克隆反应，可以很容易地检测到。示例性T-细胞丝裂原包括生物活性蛋白植物血凝素(PHA)和伴刀豆球蛋白A(ConA)，它们是凝集素(例如植物来源的碳水化合物结合蛋白)。另一种凝集素，商陆丝裂原(PWM)能够刺激T细胞和B细胞。已经描述了来自多种来源的促有丝分裂凝集素(例如Shanmugham等人，2006RivBiol.99:227；Naeem等人,2007Curr.ProteinPept.Sci8:261；Singh等人,2014Crit.Rev.Microbiol.40:329)。某些与能激活信号转导的淋巴细胞表面分子特异性结合的抗体也可以用作丝裂原。因此，通过引发/刺激在样品中容易测量的稳健的多克隆反应，丝裂原特别适用于评估含淋巴细胞的样品的总体免疫反应性，其中，由于信号强度低或抗原特异性反应淋巴细胞的频率低，单克隆或寡克隆反应的免疫检测可能不够灵敏。例如，TBGold丝裂原对照测定(例如，Mazurek等人,2005MMWRRecomm.Rep54:49-55；Mazurek等人,2010MMWRRecomm.Rep.59:1-25；Simpson等人,2012HeartLung41:553；Cho等人,2012Tuberc.Respir.Dis.(Seoul)72:416；Woo等人,2014Clin.Chim.Acta430:79)采用生物活性蛋白PHA(一种凝集素)作为多克隆丝裂原，以诱导强烈的体外T细胞反应，从而可以评估样品中T细胞的免疫反应状态。在该测试中，方便地以干燥形式提供PHA，作为在采血管的内表面上的涂层。通过在内表面上喷雾干燥含PHA的溶液，然后进行辐射灭菌(例如电子束辐射，γ射线辐照等)以杀死或灭活任何可能存在的微生物污染物，可以制备丝裂原涂覆的试管。使用化学物质代替辐射来达到无菌环境可能不是理想的，因为化学物质可能会在刺激过程中干扰细胞的生物活性和/或干扰其他检测系统。电子束辐射是本领域已知的用于对生物活性蛋白进行这种辐射灭菌的标准技术(例如，Smith等人,2016HealthPhys.111(2增补2):S141；Silindir等人,2012PDAJPharmSciTechnol.66:184；Mehta等人,1993MedDeviceTechnol.4:24；Yaman,2001Curr.Opin.DrugDevel.4:760)。期望在血液收集/培养管中具有无菌环境，以使暴露于已知生物活性测定成分(例如，促有丝分裂蛋白如PHA)后生物样品(例如全血或分离的外周血白细胞)中淋巴细胞的免疫反应能力不会因对测定/培养管中存在的微生物污染物的细胞反应而改变或被遮盖。此外，由于采血管可以直接与患者的血液接触，因此如果管中的内容物不是无菌的，就有可能将传染性病原传递给患者。然而，据报道电子束辐射灭菌会显著改变蛋白质的结构、生物学和/或免疫学特性，从而引起人们对此类辐射对生物和生物医学产品的潜在有害影响的担忧(例如，Katial等人,2002JAllergClinImmunol110:215；Terryn等人,2007IntJPharm343:4；Antebi等人,2016RevBrasOrtop51:224)。例如，电子束灭菌可能会大大降低效力，并影响无菌免疫测定/培养管中蛋白质制剂的批次间一致性，例如Gold丝裂原采血管中的PHA制剂。结果，由于末端辐射灭菌导致活性成分(例如，丝裂原)的生物活性降低，生产效率将降低。因此需要增加采集管生产中使用的原材料(例如，促有丝分裂蛋白)的输入量以补偿生物活性的损失，但是对这种增加量的需求将导致生产成本增加以及不同生产批次之间的不期望的可变性。各种出版物教导了在辐射灭菌期间通过改变溶剂含量，温度，pH，氧气含量或其他参数和/或在灭菌过程中使用各种稳定剂来保护生物组织、细胞和/或生物分子免受辐射损害的方法。从这些公开中，很明显无法预测通过给定的稳定剂或稳定剂组合对任何特定生物分子或生物分子类别的实用性、相容性以及对这些分子的辐射防护，或通过改变其他条件来实现辐射防护，而是必须根据经验确定需要保护的生物分子。例如，EP2236520描述了在选择避免冷冻生物分子的条件下生物分子的稳定化，包括稳定化以防止电磁辐射的有害影响。稳定剂包括使用最少需要的至少两种不同的氨基酸和多达18种的不同的氨基酸，优选结合2至5种不同的氨基酸。US5730933描述了通过使生物分子与外源蛋白质(例如牛血清白蛋白或变性胶原蛋白)和自由基清除剂/抗氧化剂接触并在辐照之前冷冻以及任选的冻干步骤来保护生物分子免受辐射损害。US6946098描述了将人血清白蛋白(HSA)作为稳定剂添加到生物制剂中，然后进行辐射灭菌以破坏朊病毒、病毒或其他病原体。公开了替代稳定剂的广泛列表，包括脂肪酸，抗氧化剂，自由基清除剂，肝素和硫醇化合物，但是在工作实施例中仅描述了HSA。US20030012687和US20030031584描述了使用选自多种化合物的稳定剂对组织或生物分子(例如免疫球蛋白)进行辐射防护，所述稳定剂包括脂肪酸，自由基清除剂，抗氧化剂，糖，选定的氨基酸和二肽，Trolox(CAS53188-07-1)和其他。US20030143106和US20040086420描述了使用各种抗氧化剂，脂肪酸，氨基酸，维生素和/或自由基清除剂对组织以及各种血液、血清和血浆蛋白的辐射防护。US20050069453描述了通过改变样品性质(例如，溶剂组成，pH，温度等)或通过添加大量稳定剂中的任何一种，在辐射灭菌期间对尿激酶的保护，在工作实施例中仅证明了其中的少数具有辐射防护作用。显然，需要保护生物活性蛋白和其他生物活性分子的生物活性，使其免受辐射灭菌过程中的辐射损害，以提高免疫测定产品的质量和一致性，并减少免疫测定/培养管/系统生产所需的原料量。当前公开的专利技术实施方式解决了本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种保护生物活性分子的生物活性免于辐射灭菌期间的辐射损害的方法，其包括：/n(a)在辐射灭菌之前，使水溶液中的生物活性分子与至少一种可溶性辐射防护剂化合物接触以获得辐射防护混合物；和/n(b)对辐射防护混合物进行辐射灭菌，其中辐射灭菌后的辐射防护混合物中的生物活性分子的生物活性大于在不存在辐射防护剂化合物的情况下进行辐射灭菌的对照样品中所述生物活性分子的生物活性，从而保护生物活性分子的生物学活性，使其免受辐射灭菌过程中的辐射损害。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180518 US 62/673,6711.一种保护生物活性分子的生物活性免于辐射灭菌期间的辐射损害的方法，其包括：
(a)在辐射灭菌之前，使水溶液中的生物活性分子与至少一种可溶性辐射防护剂化合物接触以获得辐射防护混合物；和
(b)对辐射防护混合物进行辐射灭菌，其中辐射灭菌后的辐射防护混合物中的生物活性分子的生物活性大于在不存在辐射防护剂化合物的情况下进行辐射灭菌的对照样品中所述生物活性分子的生物活性，从而保护生物活性分子的生物学活性，使其免受辐射灭菌过程中的辐射损害。


2.如权利要求1所述的方法，其中，所述辐射防护混合物在辐射灭菌步骤之前干燥。


3.一种保护生物活性分子的多个分子以防止在存储期间内所述多个分子丧失生物活性的方法，其包括：
(a)在辐射灭菌之前，使水溶液中的生物活性分子与至少一种可溶性辐射防护剂化合物接触以获得辐射防护混合物；
(b)干燥辐射防护混合物以获得干燥的辐射防护混合物；
(c)对干燥的辐射防护混合物进行辐射灭菌；和
(d)将干燥的辐射防护混合物储存一段时间以获得储存的干燥的辐射防护混合物，其中在所述辐射灭菌和储存所述时间段后所储存的干燥的辐射防护混合物中的所述生物活性分子的生物活性大于在不存在辐射防护剂化合物的情况下进行干燥、辐射灭菌、然后储存一段时间的对照样品中所述生物活性分子的生物活性，从而在储存期间内保护生物活性分子的多个分子免受生物活性的损失。


4.一种保护生物活性分子的生物活性免于辐射灭菌期间的辐射损害的方法，其包括：
(a)在辐射灭菌之前，使水溶液中的生物活性分子与至少一种可溶性辐射防护剂化合物接触以获得辐射防护混合物；
(b)干燥辐射防护混合物以获得干燥的辐射防护混合物；和
(c)对干燥的辐射防护混合物进行辐射灭菌以获得干燥的辐射灭菌的辐射防护混合物，其中，在将干燥的辐射灭菌的辐射防护混合物再水化以获得再水化的辐射灭菌的辐射防护混合物之后，辐射灭菌后辐射防护混合物中的生物活性分子的生物活性大于在不存在辐射防护剂化合物的情况下进行辐射灭菌的对照样品中生物活性分子的生物活性，从而保护生物活性分子的生物活性免受辐射灭菌过程中的辐射损害。


5.如权利要求1、3或4所述的方法，其中，所述生物活性分子包含以下一种或多种：(i)生物活性蛋白，(ii)丝裂原，(iii)抗体，(iv)酶，(v)细胞因子，(vi)生长因子，(vii)激素，以及(viii)具有TLR激动剂活性的生物活性咪唑并喹啉。


6.如权利要求5所述的方法，其中，所述丝裂原选自：植物血凝素(PHA)，伴刀豆球蛋白A(ConA)和商陆丝裂原(PWM)。


7.如权利要求1、3或4所述的方法，其中，所述辐射防护剂化合物包括至少一种抗氧化剂化合物。


8.如权利要求7所述的方法，其中，所述抗氧化剂化合物选自：半胱氨酸，谷胱甘肽和褪黑素。


9.如权利要求1、3或4所述的方法，其中，所述辐射防护剂化合物包括组氨酸。


10.如权利要求1、3或4所述的方法，其中，所述辐射防护剂化合物以至少0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或50毫摩尔/升的浓度存在于辐射防护混合物中。


11.如权利要求1、3或4所述的方法，其中，所述生物活性包括促有丝分裂活性。


12.如权利要求11所述的方法，其中，所述促有丝分裂活性包括诱导淋巴细胞增殖的活性。


13.如权利要求12所述的方法，其中，所述淋巴细胞增殖活性包括诱导T-细胞增殖活性。


14.如权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·Q·胡，N·P·艾伦，J·L·霍华德，J·鲍伊尔，
申请(专利权)人：凯杰科技有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US