基因疗法的方法技术

本发明专利技术提供了用于基因和/或细胞编辑的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基因疗法的方法本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2018年4月30日提交的美国临时专利申请号62/664,930和2018年4月30日提交的美国临时专利申请号62/664,932的优先权。前述申请通过引用并入本文。本专利技术是在美国国立卫生研究院授予的R01DK048252-21政府支持下完成的。政府在本专利技术中具有一定的权利。以电子方式提交的文本文件说明书在此以电子方式提交的文本文件的内容通过引用整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：SEQLIST.txt；记录日期：2019年4月29日；档案大小：116KB)。
本专利技术涉及基因和/或细胞疗法领域。具体地，公开了通过选择成功修饰的细胞用于治疗性基因和/或细胞疗法的组合物和方法。
技术介绍
在整个说明书中引用了数个出版物和专利文件，以记载与本专利技术有关的现有技术。这些引用中的每一个都通过全文引用并入本文。影响表达细胞色素p450(CYP)蛋白的细胞的许多遗传性和获得性疾病都适合基因和/或细胞疗法。从概念上讲，通过基因编辑纠正致病突变是实现基因和/或细胞疗法的最简洁和安全的方法。目前，重组腺相关病毒载体是主要的基因疗法平台。对于基因编辑应用，rAAV载体被设计为通过同源重组将治疗有效载荷整合到目标基因组位点中。但是，通过体内同源重组的精确基因编辑的效率很低，通常会导致亚治疗和无常的基因编辑。事实上，rAAV载体大部分是保持游离的并随着细胞分裂而丢失。此外，在动物和人类中，腺相关病毒的随机整合都与肝癌有关，这表明了不仅损害肝细胞，而且损害任何其他组织的风险。目前解决rAAV策略局限性的一种方法是直接修复突变。然而，以目前可用的方法进行的体内基因修复的效率也很低。另一种方法是将细胞启动子下游缺乏自身启动子的治疗性转基因整合到表达基因的染色体基因座中。然而，这种方法也被证明效率低下。这些方法的低效率可以通过选择性放大带有所需基因编辑事件的细胞来克服。例如，通过在内含子内使用嵌入微小RNA(microRNA)中的短发夹RNA(shRNA)来敲落酪氨酸分解代谢酶4-OH-苯丙酮酸双加氧酶(HHPD)，可以通过对4-[(2-羧乙基)-羟基氧膦基]-3-氧代丁酸酯(CEHPOBA)——一种富马酰乙酰乙酸酯水解酶的小分子抑制剂——赋予药物诱导的毒性抗性来选择表达正确靶向白蛋白基因座的人因子9的肝细胞(Nygaard等人(2016)Sci.Transl.Med.,8(342):342ra79)。然而，使用CEHPOBA和利用酪氨酸分解代谢途径进行选择在体内的应用有限。鉴于上述情况，很明显需要基因和/或细胞疗法的优良方法。
技术实现思路
根据本专利技术，提供了繁殖和/或扩增细胞群的方法。还提供了在细胞或受试者中表达目的核酸(例如，转基因)的方法(例如，改进的细胞和/或基因疗法方法)。在一些实施方案中，所述方法包括抑制(例如，敲除或敲落)细胞中的一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR，并对所述细胞施用前药(原毒素)。所述方法可以进一步包括在用前药选择之前对所述细胞施用目的核酸(例如，转基因)。所施用的前药(原毒素)在未处理的细胞中代谢成毒素，但在处理的细胞中不代谢成毒素，从而允许繁殖和/或扩增所需的细胞群和/或表达目的核酸(例如转基因)。所述方法的步骤可以在体内和/或体外进行。在某些实施方案中，抑制一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR的步骤可以在体外或体内进行。在某些实施方案中，通过将前药(原毒素)施用于受试者来进行施用前药(原毒素)的步骤。抑制一种或多种CYP酶、CTNNB1和/或CYPOR的步骤可以通过向细胞施用抑制性核酸分子和/或利用基因编辑工具(如CRISPR)来进行。附图说明图1提供了总体示意图，其示出了通过失活惰性前药(原毒素)成为毒性代谢物的代谢来实现药物选择的原理。细胞的正常状态如左图所示，其中前药(原毒素)被代谢成毒性代谢物。CYP酶、细胞色素P450还原酶(CYPOR或POR)或β-连环蛋白(Ctnnb1)的敲落或敲除保护细胞并使其增殖。图2提供了在注射pX330-Cypor并用对乙酰氨基酚处理的小鼠中随着时间推移的血液丙氨酸转氨酶(ALT)水平——一种肝损伤的指标——的图。图3提供了未经处理(上部组图)或用对乙酰氨基酚处理(下部组图)的以pX330-Cypor转导的小鼠肝脏样品的CYPOR免疫组织化学图像。虚线表示无CYPOR的结节。图4提供了以下小鼠中插入缺失(indel)的百分比图：注射以对照质粒(pX330)、未经对乙酰氨基酚选择的pX330-Cypor、注射对乙酰氨基酚的pX330-Cypor和具有对乙酰氨基酚饮食的pX330-Cypor。图5提供了未经处理(左图)或用对乙酰氨基酚处理(右图)的注射了Cyp1A2/2E1CRISPR敲除质粒的小鼠肝脏样品的免疫组织化学图像。箭头指示了无Cyp2E1的结节。图6提供了用GFP转座子转导的小鼠肝脏样品的CYPOR免疫组织化学和荧光成像，所述转座子带有对照shRNA(上部组图)或CyporshRNA(下部组图)，并用对乙酰氨基酚处理。图7提供了自裂解指导RNA的示意图。锤头状核酶是SEQIDNO：521。HDV核酶是SEQIDNO：522。成熟的gRNA是SEQIDNO：523。图8提供了新生小鼠肝脏的荧光素酶图像，所述新生小鼠注射了包含荧光素酶和针对Cypor的自裂解指导RNA的载体，并在断奶时注射了cas9，随后注射对乙酰氨基酚8周。在基线和5、11和16剂后，对同一只小鼠进行了实时荧光素酶成像。图9提供了小鼠血液中人因子IX水平的图，所述小鼠在新生儿时被注射生理盐水或AAVGRCyporF9并在断奶时被给予单剂量的Cas9。然后对小鼠不进行处理或每周两次用对乙酰氨基酚处理。在0、3、9和15剂对乙酰氨基酚后测量人因子IX水平。图10提供了注射有AAVGRCyporF9并用对乙酰氨基酚处理的成年小鼠血液中人因子IX水平的图。在0、2、7、13和19剂后确定人因子IX的水平。图11提供了对乙酰氨基酚处理后来自GRCyporF9处理的小鼠的组织样品的CYPOR(上部组图)和人因子IX(下部组图)的免疫组织化学图像。在上部组图中，CYPOR阴性组织由虚线和箭头指示。在下部组图中，用虚线和箭头指示了对人因子IX呈阳性的小鼠肝细胞。具体实施方式通过使用以下方法可以克服基因和/或细胞疗法中观察到的阻碍：(1)设计用于利用和/或破坏CYP酶代谢活性所需的任何基因位点的方法，其中通过药物诱导的毒性的抗性细胞群的选择性放大和/或扩增在体内的广泛应用受毒素影响，(2)位点特异性基因编辑方法，其被设计用于将所需修饰与顺式选择性基因破坏联系起来，使得仅当修饰发生在特定位点时才发生选择性放大和/或细胞放大，(3)位点特异性基因编辑方法，其被设计用于实现所需的修饰和可选择的基因破坏，所述方法不需要核酸内切酶切割DNA或使用启动子激活基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在受试者中选择性放大和/或扩增细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：/na)抑制细胞中的细胞色素p450(CYP)酶、细胞色素p450还原酶(POR)和/或β-连环蛋白(CTNNB1)；以及/nb)向具有通过步骤a)产生的细胞的受试者施用原毒素，/n其中所述原毒素在通过步骤a)产生的细胞中不转化为毒性代谢物，从而允许所述受试者内的所述细胞放大和/或扩增。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180430 US 62/664,932;20180430 US 62/664,9301.一种用于在受试者中选择性放大和/或扩增细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：
a)抑制细胞中的细胞色素p450(CYP)酶、细胞色素p450还原酶(POR)和/或β-连环蛋白(CTNNB1)；以及
b)向具有通过步骤a)产生的细胞的受试者施用原毒素，
其中所述原毒素在通过步骤a)产生的细胞中不转化为毒性代谢物，从而允许所述受试者内的所述细胞放大和/或扩增。


2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤b)之前将转基因导入所述细胞。


3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是肝细胞。


4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)在体外进行，并且在步骤b)之前将所述细胞施用于所述受试者。


5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)在体内进行。


6.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)包括向所述细胞或受试者施用抑制性核酸分子或编码抑制性核酸分子的核酸分子，其中所述抑制性核酸分子对CYP酶、POR或CTNNB1具有特异性。


7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抑制性核酸分子是shRNA。


8.根据权利要求6所述的方法，其中步骤a)包括向所述细胞或受试者施用载体，所述载体包含编码所述抑制性核酸分子的核酸分子以及转基因。


9.根据权利要求8所述的方法，其中所述载体是病毒载体。


10.根据权利要求9所述的方法，其中所述病毒载体是AAV载体。


11.根据权利要求8所述的方法，其中所述载体是整合载体。


12.根据权利要求11所述的方法，其中所述整合载体缺乏启动子。


13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)包括通过基因编辑使CYP酶、POR和/或CTNNB1失活。


14.根据权利要求13所述的方法，其中步骤a)包括向所述细胞或受试者施用Cas9和对CYP酶、POR或CTNNB1基因具有特异性的指导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核酸分子，其中所述gRNA序列与...

【专利技术属性】
技术研发人员：马库斯·格罗佩，阿弥达·蒂亚波恩查，
申请(专利权)人：俄勒冈健康科学大学，
类型：发明
国别省市：美国;US