一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒，包括吖啶酯标记76‑G3‑G5检测抗体、生物素标记8‑A8‑B8捕获抗体；所述吖啶酯标记76‑G3‑G5检测抗体是将单克隆抗体76‑G3‑G5通过吖啶酯标记后制得，所述单克隆抗体76‑G3‑G5是由杂交瘤细胞株76‑G3‑G5分泌获得；所述生物素标记8‑A8‑B8捕获抗体是先将单克隆抗体8‑A8‑B8利用生物素标记，然后再与包埋有亲和素的磁珠结合后制得，所述单克隆抗体8‑A8‑B8是由杂交瘤细胞株8‑A8‑B8分泌获得。在制备筛选杂交瘤细胞株时采用质粒免疫和蛋白免疫相结合的方式，检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、精密度高、稳定性好，操作安全，方法简便快速。

【技术实现步骤摘要】
一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒
本专利技术属于人可溶性CD14(Presepsin)的检测
，特别是一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒。
技术介绍
脓毒症发生率高，全球每年有超过1800万严重脓毒症病例，并且这一数字还以每年1.5％～8.0％的速度上升。脓毒症的病情凶险，病死率高，全球每天约14,000人死于其并发症。据流行病学调查显示，脓毒症的病死率已经超过心肌梗死，成为重症监护病房内非心脏病人死亡的主要原因。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持技术取得了长足的进步，脓毒症的病死率仍高达30％～70％。脓毒症治疗花费高，医疗资源消耗大，严重影响人类的生活质量，已经对人类健康造成巨大威胁。脓毒血症所致的反应是一个非常复杂的连锁过程，涉及促炎和抗炎过程，体液反应和细胞反应以及血流动力学异常。随着人口老龄化，侵入性操作增加和耐药微生物的持续出现，脓毒症的发生率不断上升。早期诊断脓毒血症有助于快速治疗、改善预后和减少不必要的抗生素治疗。目前，对于脓毒血症的诊断没有理想的金标准，因为微生物学阳性率低，常规实验室检查没有特异性。生物标志物可以在这个过程中发挥重要作用，因为它们可以指示脓毒血症的存在或不存在或严重程度，指导临床医生作出快速诊断，选择合理高效的治疗方案。PCT(降钙素原)诊断脓毒症敏感度和特异度跨度较大，并不能有效区分是细菌感染还是非细菌感染引起的全身炎性反应综合征。Presepsin又称sCD14-ST。CD14分为膜性CD14(m-CD14)和可溶性CD14(s-CD14)。mCD14是细胞膜上的一种糖蛋白，是脂多糖和脂多糖结合蛋白的受体，可以激活PTK和MAPK通路，引起炎症反应，激活凝血和纤溶系统，引起脓毒血症、脓血性休克、弥散性血管内凝血(DIC)、(多器官功能障碍综合征)MODS。Presepsin产生的主要起因是细菌入侵，许多细菌产物，包括革兰阳性(G+)菌细胞壁的主要成分肽聚糖，革兰阴性(G-)菌细胞壁的内毒素脂多糖(LPS)和脂多糖结合蛋白(LBP)作为受体与mCD14结合，脱落至血浆形成sCD14，随后被蛋白酶组织酶D等蛋白酶水解成sCD14-ST。脓毒血症患者Presepsin水平显著高于局部感染者，Presepsin早期诊断价值更高，可有效区分是细菌感染还是非细菌感染引起的全身炎性反应综合征，同时Presepsin的诊断准确度高于PCT。因此，Presepsin作为新的感染相关生物学指标在脓毒症早期诊断和指导治疗方面具有显著优势。目前，临床有多种生物标志物，如血清降钙素原(PCT)、C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF)、髓系细胞表达的触发受体-1(TREM-1)等用于单独或联合诊断脓毒血症。其中以PCT在国内外研究最多、最广，但在严重创伤、大面积烧伤、器官移植、胰腺炎、外科手术等非感染的SIRS患者中，PCT浓度也可升高。因此，PCT的诊断性能较低，其诊断脓毒症的敏感性和特异性的均值均为7l％(95％可信区间为67％～76％)，故PCT不能单独在急危重患者中用来鉴别脓毒血症，必须要结合其他指标综合评估、诊断。通常情况在临床上对疑似感染而发热的患者，根据外周血白细胞计数(WBC)、中性粒百分比(Neu％)的结果来初步判断是否存在细菌感染。实际上，外周血白细胞计数、中性粒百分比的高低易受诸多因素的影响，机体受感染的程度及感染时的免疫状态都会使其变化，所以特异性和敏感性都有较大的局限性。针对Presepsin这一新型脓毒症标志物，可有效的区分局部感染和脓毒血症，较PCT在诊断脓毒血症效能上更高，可以作为早期诊断脓毒血症的有效指标。目前国内尚无厂家有相关产品上市，因此开发一种具有核心原料的化学发光诊断试剂盒具有非常重要的意义。
技术实现思路
针对以上现有技术的不足，本专利技术提供了一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒，具体通过以下技术实现。一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒，包括吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体、生物素标记8-A8-B8捕获抗体；所述吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体是将单克隆抗体76-G3-G5通过吖啶酯标记后制得，所述单克隆抗体76-G3-G5是由杂交瘤细胞株76-G3-G5分泌获得；所述生物素标记8-A8-B8捕获抗体是先将单克隆抗体8-A8-B8利用生物素标记，然后再与包埋有亲和素的磁珠结合后制得，所述单克隆抗体8-A8-B8是由杂交瘤细胞株8-A8-B8分泌获得；所述杂交瘤细胞株76-G3-G5保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCCNO：C2020139，保藏日期2020年08月11日，保藏地址是中国.武汉.武汉大学；所述杂交瘤细胞株8-A8-B8保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCCNO：C2020140，保藏日期2020年08月11日，保藏地址是中国.武汉.武汉大学。除上述试剂以外，上述化学发光试剂盒还包括市面上常用的人工合成人可溶性CD14标准品、人工合成人可溶性CD14质控品、磷酸盐(PBS)缓冲液、吖啶酯标记碳酸盐(CBS)缓冲液、生物素标记碳酸盐(CBS)缓冲液、稀释生物素标记的抗体试剂缓冲液R1、稀释吖啶酯标记的抗体试剂缓冲液R2、磁珠及磁珠稀释液、标准品和质控品稀释液；上述试剂盒中，吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体、生物素标记8-A8-B8捕获抗体已与2020年08月17日保存至中国典型培养物保藏中心并存活。通过将吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体、生物素标记8-A8-B8捕获抗体与人可溶性CD14放入孵育槽中孵育，使吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体和生物素标记8-A8-B8捕获抗体分别与人可溶性CD14结合得到双抗体夹心复合物。所用的杂交瘤细胞株76-G3-G5和8-A8-B8是从筛选出的若干种不同的杂交瘤细胞株中进一步筛选出的。经过验证可知，只有将杂交瘤细胞株76-G3-G5分泌的单克隆抗体76-G3-G5与吖啶酯标记，将杂交瘤细胞株8-A8-B8分泌的单克隆抗体8-A8-B8与生物素标记，再与磁珠结合，形成的双抗体夹心复合物才能具有最好的灵敏度、精密度。而如果反过来将单克隆抗体8-A8-B8与吖啶酯标记，单克隆抗体76-G3-G5与生物素结合，或者采用筛选出的其他杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体标记，所获得双抗体夹心复合物均不能获得最佳的灵敏度、精密度均。人可溶性CD14标准品、人可溶性CD14质控品、磷酸盐(PBS)缓冲液、吖啶酯标记碳酸盐(CBS)缓冲液、生物素标记碳酸盐(CBS)缓冲液、稀释生物素标记的抗体试剂缓冲液R1、稀释吖啶酯标记的抗体试剂缓冲液R2、磁珠稀释液、标准品(质控品)稀释液等属于市面上销售的，或常用的试剂，其配置方法也属于常见的配置方法。优选地，所述杂交瘤细胞株76-G3-G5和杂交瘤细胞株8-A8-B8是利用人工合成的人可溶性CD14基因制备重组质粒，进行蛋白质表达纯化，再通过动物免疫、细胞融合、间接Elisa筛选、亚克隆获得若干杂交瘤细胞株本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒，其特征在于，包括吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体、生物素标记8-A8-B8捕获抗体；/n所述吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体是将单克隆抗体76-G3-G5通过吖啶酯标记后制得，所述单克隆抗体76-G3-G5是由杂交瘤细胞株76-G3-G5分泌获得；/n所述生物素标记8-A8-B8捕获抗体是先将单克隆抗体8-A8-B8利用生物素标记，然后再与包埋有亲和素的磁珠结合后制得，所述单克隆抗体8-A8-B8是由杂交瘤细胞株8-A8-B8分泌获得；/n所述杂交瘤细胞株76-G3-G5保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：C2020139；所述杂交瘤细胞株8-A8-B8保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCC NO：C2020140。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测人可溶性CD14的化学发光试剂盒，其特征在于，包括吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体、生物素标记8-A8-B8捕获抗体；
所述吖啶酯标记76-G3-G5检测抗体是将单克隆抗体76-G3-G5通过吖啶酯标记后制得，所述单克隆抗体76-G3-G5是由杂交瘤细胞株76-G3-G5分泌获得；
所述生物素标记8-A8-B8捕获抗体是先将单克隆抗体8-A8-B8利用生物素标记，然后再与包埋有亲和素的磁珠结合后制得，所述单克隆抗体8-A8-B8是由杂交瘤细胞株8-A8-B8分泌获得；
所述杂交瘤细胞株76-G3-G5保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCCNO：C2020139；所述杂交瘤细胞株8-A8-B8保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏编号为CCTCCNO：C2020140。


2.根据权利要求1所述的化学发光试剂盒，其特征在于，所述杂交瘤细胞株76-G3-G5和杂交瘤细胞株8-A8-B8的筛选配对获得的具体方法如下：
S1、人工合成人可溶性CD14基因，将人可溶性CD14基因重组到表达载体质粒pATX2-FC中，得到sCD14-pATX1-FC表达载体质粒；克隆位点为EcoRI/XbaI，人可溶性CD14基因的基因序列如SEQNO.1所示；
制备mGM-CSF免疫佐剂质粒的基因序列如SEQNO.2所示；
S2、将sCD14-pATX1-FC表达载体质粒转染到293F细胞系中培养，收集上清液进行镍柱纯化得到人可溶性CD14；
S3、将sCD14-pATX1-FC表达载体质粒和mGM-CSF免疫佐剂质粒加至乳酸林格氏缓冲液中，sCD14-pATX1-FC表达载体质粒和mGM-CSF免疫佐剂质粒的浓度分别为200μg/mL、2.5μg/mL；对小鼠进行尾静脉注射，注射剂量2mL/次，每周免疫1次，共免疫3次；
第3次免疫结束后，用人可溶性CD14免疫若干小鼠，每只小鼠的免疫剂量为50μg，取血清效价检测合格的小鼠进行细胞融合，再进行间接Elisa筛选，将筛选得到的阳性克隆用有限稀释法进行亚克隆，得到若干株杂交瘤细胞株；
S4、将步骤S3所得的若干杂交瘤细胞株分泌的抗体分别进行吖啶酯标记和生物素标记，得到吖啶酯标记的检测抗体和生物素标记的捕获抗体，并制备人可溶性CD14的标准品、质控品；
S5、选择步骤S4所得吖啶酯标记的...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷坤，代腾飞，秦伏波，鲁亮，万定一，张永霞，
申请(专利权)人：普健生物武汉科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42