一种异常糖链糖蛋白的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种异常糖链糖蛋白的检测方法：第一步，样本制备及检测，包括S1样本处理、S2样本孵育、S3分离、S4封闭、S5生物素标记的凝集素识别糖链异常蛋白、S6采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的链霉亲和素进行信号放大、第二步，制作标准曲线，在0‑20000ng/ml范围内，制备4个及以上不同质量浓度的异常糖链糖蛋白样品作为标准品，按照步骤S2‑S6对标准品进行处理，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪获得发光值，将除0值以外的质量浓度和对应的发光值均转换成以2为底的对数，代入至四参数logistic曲线y=(A‑D)/[1+(x/C)^B]+D，得到标准曲线；第三步，样本浓度的计算。本发明专利技术的方法可以对不同类型的异常糖链糖蛋白进行单独分析，实现定量检测，准确率高。

【技术实现步骤摘要】
一种异常糖链糖蛋白的检测方法
本专利技术属于免疫检测
，具体涉及一种异常糖链糖蛋白的检测方法。
技术介绍
蛋白质糖基化作为一种重要的翻译后修饰，对蛋白质结构和功能起着重要的作用，已发现在哺乳动物细胞中，约50％的蛋白有糖基化发生，这种修饰在细胞识别、粘附、细胞间相互作用和生长发育等许多细胞功能中发挥关键作用。异常糖链糖蛋白主要由糖基化不完全或新的糖基转移酶被激活而产生新的糖基化引起，大量研究表明异常糖链糖蛋白的产生与肿瘤关系密切，如恶性肿瘤患者甲胎蛋白、转铁蛋白、碱性磷酸酶、r-谷氨酰转移酶、人绒毛膜促性腺激素、T抗原、a1抗胰蛋白酶及前列腺酸性磷酸酶等糖链结构发生改变，达到一定程度后，此类物质向血液排放，并较多地存在于外周血液种。凝集素是一种从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白或结合糖的蛋白。它具有能与糖蛋白专一性、非共价可逆结合的特点。凝集素对糖蛋白的结合强度可随分子相互作用的数目增加，凝集素对糖蛋白的结合解离常数为约Kd10-5～10-7。现有技术中，已经存在利用异常糖链糖蛋白与不同植物凝集素的亲和性，用于各种类型的肿瘤的诊断。但现有技术的检测方法存在如下缺陷：其一，凝集素未做有效的预处理，其稳定性存在不足，影响检测的可靠性；凝集素的抗蛋白水解能力也需要进一步通过预处理的方式改善。其三，检测方法的操作步骤存在可优化的空间，现有技术无法实现定量检测。本专利技术旨在提供一种基于新型异常糖链糖蛋白检测试剂的异常糖链糖蛋白的检测方法。>
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于解决现有技术的不足，提供提供一种基于新型异常糖链糖蛋白检测试剂的异常糖链糖蛋白的检测方法。该方法能够有效的兼顾广谱性和准确性，另外，凝集素采用预处理，稳定性显著的改善，检测方法的可靠性好，而且预处理后的凝集素抗蛋白水解能力也显著提高。另外检测方法的操作步骤更合理，可靠性高。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案如下：一种异常糖链糖蛋白的检测方法，所述检测方法的步骤如下：第一步，样本制备及检测S1样本处理将待测标本使用样本稀释液稀释至1-20000倍，待测标本充分混匀获得样本液；S2样本孵育样本液置于固相A的孔中，所述固相A为聚苯乙烯和/或聚丙烯材质发光板，样本液pH控制在9.40-9.60，室温孵育2-3h或37℃恒温孵育30-60min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相A上；或者，样本液置于反应杯，加入固相B，所述固相B为磁性微球，样本液pH控制在7.00-7.20，室温孵育2-3h或37℃恒温孵育30-60min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相B上；S3分离针对结合在固相A的，倾倒掉残余的样本稀释液，每孔加入300ul洗液，静置30s-60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；针对结合在固相B的，将反应杯在磁分离器上静置1min-2min，每个反应杯加入300ul洗液，静置30s-60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；S4封闭采用质量百分比0.5%-1.5%的牛血清白蛋白、乳清蛋白和酪蛋白中的一种或多种为封闭剂，于pH7.00-7.20，4℃过夜或37℃恒温封闭1.5h，每孔或反应杯封闭剂用量：300ul，封闭完毕后，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；S5生物素标记的凝集素识别糖链异常蛋白每孔或反应杯使用生物素标记的凝集素的浓度及用量：0.1-10ug/ml，50-200ul，pH：7.00-7.20，反应时间：室温孵育2-3h或者37℃恒温孵育1h，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；S6采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的链霉亲和素进行信号放大辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和SA的标记比例：1：（1-10），每孔或反应杯使用浓度及用量：0.05-0.2ug/ml，50-200ul，pH：7.00-7.20，反应时间：室温孵育30-60min或者37℃恒温孵育15min，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；第二步，制作标准曲线在0-20000ng/ml范围内，制备4个及以上不同质量浓度的异常糖链糖蛋白样品作为标准品，按照步骤S2-S6对标准品进行处理，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪获得发光值，将除0值以外的质量浓度和对应的发光值均转换成以2为底的对数，代入至四参数logistic曲线y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，线性拟合得到标准曲线；第三步，样本浓度的计算对步骤S6的样品，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪检测获取发光值，代入标准曲线，计算获得待测标本中糖链异常蛋白的浓度。优选的，步骤S1中，所述样本为血清、血浆和体液中的任意一种，固相A的结合异常糖链糖蛋白的能力不低于1000ng/cm2，固相B结合异常糖链糖蛋白的能力不低于80ng异常糖链糖蛋白/10ug磁性微球。优选的，所述固相A采用96孔发光板，每孔样本量50-200μl，所述固相B的浓度为0.1-0.5mg/ml，每反应杯中样本量10-200μl，固相B的添加量为50-200μl。优选的，步骤S5中，凝集素与生物素的质量比为1：（1-5）。优选的，针对固相A的样本稀释液，其组成如下：碳酸钠0.5-1.0g，碳酸氢钠10-15g，纯化水定容至1L；针对固相B的样本稀释液，其组成如下：NaH2PO4.2H2O：0.5-1g，Na2HPO4.12H2O：2-3g，纯化水定容至1L。优选的，生物素标记的凝集素及辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的链霉亲和素所用的稀释液，其组成如下：NaH2PO4.2H2O：0.5-1gNa2HPO4.12H2O：2-3gZn2+：0.01-0.02gMg2+：0.2-0.4g纯化水定容至1L。优选的，凝集素为刀豆凝集素、曼陀罗凝集素、小扁豆凝集素、麦胚凝集素、E型红腰豆凝集素、L型红腰豆凝集素、桔果粉孢凝集素、花生凝集素、蓖麻凝集素I、朝鲜槐凝集素、橙黄网胞盘菌凝集素、双孢蘑菇凝集素、接骨木黑素凝集素和怀槐凝集素ІІ中的任意一种或几种的混合，所述凝集素经由PEG预修饰处理。优选的，凝集素的PEG预修饰处理的步骤如下：S1：将碳二亚胺、甲氧基聚乙二醇活性酯和凝集素混合，在室温反应2-6h；S2：使用葡聚糖凝胶SwphadexG-50分离步骤S1的反应体系中的目标产物，获取第一段峰的物质，获得目标产物，即为PEG预修饰后的凝集素。优选的，碳二亚胺、甲氧基聚乙二醇活性酯和凝集素的质量比为1:100:1。本专利技术中，凝集素使用前要使用PEG进行修饰，以增强其稳定性，使其抵抗蛋白酶水解的能力提高，并改善其在干燥后反应过程中的溶解性，利于形成均一的、特异性的反应体系。本专利技术有以下有益效果：本专利技术的方法可以对不同类型的异常糖链糖蛋白进行单独分析，另外实现定量检测，准确率高，可靠性好。具体实施方式...

【技术保护点】
1.一种异常糖链糖蛋白的检测方法，其特征在于，所述检测方法的步骤如下：/n第一步，样本制备/nS1样本处理/n将待测标本使用样本稀释液稀释至1-20000倍，待测标本充分混匀获得样本液；/nS2样本孵育/n样本液置于固相A的孔中，所述固相A为聚苯乙烯和/或聚丙烯材质发光板，样本液pH控制在9.40-9.60，室温孵育2-3h或37℃恒温孵育30-60min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相A上；或者，样本液置于反应杯，加入固相B，所述固相B为磁性微球，样本液pH控制在7.00-7.20， 室温孵育2-3h或37℃恒温孵育30-60min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相B上；/nS3分离/n针对结合在固相A的，倾倒掉残余的样本稀释液，每孔加入300ul洗液，静置30s-60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；针对结合在固相B的，将反应杯在磁分离器上静置1min-2min，每个反应杯加入300ul洗液，静置30s-60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；/nS4封闭/n采用质量百分比0.5%-1.5%的牛血清白蛋白、乳清蛋白和酪蛋白中的一种或多种为封闭剂，于pH7.00-7.20，4℃过夜或37℃恒温封闭1.5h，每孔或反应杯封闭剂用量：300ul，封闭完毕后，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；/nS5生物素标记的凝集素识别糖链异常蛋白/n每孔或反应杯使用生物素标记的凝集素的浓度及用量：0.1-10ug/ml，50-200ul， pH：7.00-7.20，反应时间： 室温孵育2-3h或者37℃恒温孵育1h，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；/nS6采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的链霉亲和素进行信号放大/n辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和SA的标记比例：1：（1-10），每孔或反应杯使用浓度及用量：0.05-0.2ug/ml，50-200ul，pH：7.00-7.20，反应时间： 室温孵育30-60min或者37℃恒温孵育15min，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；/n第二步，制作标准曲线/n在0-20000ng/ml范围内，制备4个及以上不同质量浓度的异常糖链糖蛋白样品作为标准品，按照步骤S2-S6对标准品进行处理，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪获得发光值，将除0值以外的质量浓度和对应的发光值均转换成以2为底的对数，代入至四参数logistic曲线y = (A - D) / [1 + (x/C)^B] + D，线性拟合得到标准曲线；/n第三步，样本浓度的计算/n对步骤S6的样品，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪检测获取发光值，代入标准曲线，计算获得待测标本中糖链异常蛋白的浓度。/n...

【技术特征摘要】
1.一种异常糖链糖蛋白的检测方法，其特征在于，所述检测方法的步骤如下：
第一步，样本制备
S1样本处理
将待测标本使用样本稀释液稀释至1-20000倍，待测标本充分混匀获得样本液；
S2样本孵育
样本液置于固相A的孔中，所述固相A为聚苯乙烯和/或聚丙烯材质发光板，样本液pH控制在9.40-9.60，室温孵育2-3h或37℃恒温孵育30-60min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相A上；或者，样本液置于反应杯，加入固相B，所述固相B为磁性微球，样本液pH控制在7.00-7.20，室温孵育2-3h或37℃恒温孵育30-60min，通过孵育使稀释后的样本结合在固相B上；
S3分离
针对结合在固相A的，倾倒掉残余的样本稀释液，每孔加入300ul洗液，静置30s-60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；针对结合在固相B的，将反应杯在磁分离器上静置1min-2min，每个反应杯加入300ul洗液，静置30s-60s，倾倒洗液，如此重复2-3次；
S4封闭
采用质量百分比0.5%-1.5%的牛血清白蛋白、乳清蛋白和酪蛋白中的一种或多种为封闭剂，于pH7.00-7.20，4℃过夜或37℃恒温封闭1.5h，每孔或反应杯封闭剂用量：300ul，封闭完毕后，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；
S5生物素标记的凝集素识别糖链异常蛋白
每孔或反应杯使用生物素标记的凝集素的浓度及用量：0.1-10ug/ml，50-200ul，pH：7.00-7.20，反应时间：室温孵育2-3h或者37℃恒温孵育1h，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；
S6采用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的链霉亲和素进行信号放大
辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶和SA的标记比例：1：（1-10），每孔或反应杯使用浓度及用量：0.05-0.2ug/ml，50-200ul，pH：7.00-7.20，反应时间：室温孵育30-60min或者37℃恒温孵育15min，针对不同的固相，按照S3的分离操作进行分离；
第二步，制作标准曲线
在0-20000ng/ml范围内，制备4个及以上不同质量浓度的异常糖链糖蛋白样品作为标准品，按照步骤S2-S6对标准品进行处理，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪获得发光值，将除0值以外的质量浓度和对应的发光值均转换成以2为底的对数，代入至四参数logistic曲线y=(A-D)/[1+(x/C)^B]+D，线性拟合得到标准曲线；
第三步，样本浓度的计算
对步骤S6的样品，基于化学发光免疫分析仪或半自动发光仪检测获取发光值，代入标准曲线，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆修委，郭清，陆帅锋，赵筱瑜，
申请(专利权)人：浙江紫荆生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33