快速检测猪肠道内容物/粪便中B族维生素含量的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速检测猪肠道内容物/粪便中B族维生素含量的方法，包括以下步骤：称取猪的盲肠内容物/粪便作为样本，加入甲醇/乙腈/水溶液，匀质提取，得样品溶液；样品溶液进行UPLC‑MS/MS‑MRM检测分析，最终获得样本中8种B族维生素含量；所述8种B族维生素为：维生素B

【技术实现步骤摘要】
快速检测猪肠道内容物/粪便中B族维生素含量的方法
本专利技术属于畜牧兽医领域，具体涉及一种快速检测猪肠道内容物B族维生素的方法。
技术介绍
B族维生素是多种辅酶和酶的组成成分，参与体内重要的代谢活动。肠道微生物合成是宿主B族维生素的重要来源之一，B族维生素是肠道微生物的重要代谢产物，在肠道发育、免疫功能及营养代谢等方面有重要作用，被作为饲料添加剂广泛应用于畜禽养殖。准确掌握B族维生素在肠道内容物中的动态变化，对于研究B族维生素在肠道中的生物学功能具有重要意义。目前现有的高效液相色谱法(HLPC)、高效毛细管电泳法、微生物法、荧光法等方法，这些方法大多是针对单项或少数几项B族维生素含量的检测方法，且存在耗时长、前处理繁杂，检出限高、特异性低等问题。目前，这些方法主要用于检测B族维生素含量较高的食品或者饲料预混料中的B族维生素检测，由于动物肠道内容物/粪便中B族维生素含量极低，上述方法均难以准确检测肠道内容物中B族维生素含量，导致利用B族维生素含量动态变化调控肠道健康的研究受到严重限制。最新研究发现，超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)结合多选择反应监测(MultipleReactionMonitoring,MRM)技术开展靶向代谢组学研究，可以对低含量生物样品进行高效定量测定。梁敏慧等建立了UPLC-MS/MS-MRM技术测定食品中叶酸、烟酸、生物素和泛酸的含量的方法，王任等通过试验建立了UPLC-MS/MS-MRM技术分析复合维生素片中叶酸和生物素含量的方法。但是，关于高效定量测定猪肠道内容物/粪便中多种B族维生素含量的方法尚缺乏。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种快速检测猪肠道内容物中多种B族维生素的方法，该方法利用MRM技术，结合超高效液相色谱系统和质谱仪，是基于MRM方法的靶向代谢组学，能够快速检测猪肠道内容物、粪便等样品中多种B族维生素的含量。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种快速检测猪肠道内容物/粪便中B族维生素含量的方法，包括以下步骤：1)、样本前处理；称取猪200±10mg的盲肠内容物/粪便作为样本，加入至750±50μL甲醇/乙腈/水溶液，匀质提取，得样品溶液；甲醇/乙腈/水溶液中，甲醇/乙腈/水＝2:2:1的体积比；2)、样品检测：将步骤1)前处理所得的样品溶液低温高速离心(4℃，14000r/min，离心15min)；取500μL上清液Ⅰ过Ostro磷脂去除板(以减少基质效应干扰响应和灵敏度)，氮气(37℃氮气)吹干；然后加入100μL0.3％甲酸水溶液进行复溶，低温高速离心(4℃，14000r/min，离心10min)；所得的上清液Ⅱ进行UPLC-MS/MS-MRM检测分析；3)、将上清液Ⅱ检测所得的峰面积带入对应的B族维生素标准曲线(线性方程)中，获得上清液Ⅱ中8种B族维生素含量，然后经过换算，得到样本中8种B族维生素含量；所述8种B族维生素为：维生素B1、维生素B2、烟酸、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、维生素B9、维生素B12。作为本专利技术的快速检测猪肠道内容物/粪便中B族维生素含量的方法，UPLC-MS/MS-MRM检测分析：超高效液相色谱为：采用WatersACQUITYUPLCI-Class系统进行分离；色谱柱：Waters，HSST3(2.5μm,2.1mm×100mmcolumn)；柱温：45℃；流动相：A液为0.3％(体积％)甲酸水溶液，B液为甲醇；进样流速为300μL/min，进样量为5μL；液相梯度如下：0～2.0min，B液为0；2.0～3.0min，B液从0线性变化到50％；3.0～4.5min，B液从50％线性变化到100％；4.5～5.5min，B液从100％线性变化到0；5.5～11min，B液为0。上述％为体积％；质谱分析为：采用5500QTRAP质谱仪(ABSCIEX)在正离子模式下进行质谱分析；离子化模式：ESI+，离子喷雾电压:+4500V，离子源温度：550℃，气帘气(CUR)40.00psi，雾化气(GS1)55.00psi，辅助气(GS2)55.00psi，采用多选择反应监测(MRM)模式检测待测离子对，MRM条件如下：作为本专利技术的的快速检测猪肠道内容物/粪便中B族维生素含量的方法的改进：将维生素B1、维生素B2、烟酸、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、维生素B9、维生素B12分别进行如下操作：配制成梯度标准工作溶液；将梯度标准工作溶液注入气相色谱-质谱联用仪，选择离子监测(MRM)模式测定，确定各B族维生素的出峰位置，记录定量离子的峰面积，以B族维生素各标准液浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，制作标准曲线，得到线性回归方程。作为本专利技术的的快速检测猪肠道内容物/粪便中B族维生素含量的方法的进一步改进：维生素B1的线性方程为Y＝0.238X-8.689；维生素B2的线性方程为Y＝0.0225X-2.172；烟酰胺的线性方程为Y＝0.0267X-11.060；烟酸的线性方程为Y＝0.0299X+4.252；吡哆醇的线性方程为Y＝0.0503X+0.0981；吡哆醛的线性方程为Y＝0.0232X-0.0404；维生素B9的线性方程为Y＝0.00800X-0.0328；维生素B12的线性方程为Y＝0.00445X-0.0333。本专利技术的方法能够同时检测多种B族维生素(VB1、VB2、烟酸、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、VB9、VB12)，具有检测下限低(0.01～0.1ng/ml)、样品前处理简单、检测快速(全程耗时1-2h)、高通量等优点。本专利技术的方法能够快速检测猪肠道内容物、粪便等样品中的多种B族维生素的含量，在其他畜禽样品检测中也具有应用前景。本专利技术利用UPLC-MS/MS-MRM技术开展靶向代谢组学分析，通过优化样品前处理步骤和试验条件，高效、定量地检测猪盲肠内容物/粪便中8种B族维生素含量。董爽等利用微生物法检测饲料中的烟酸含量，平均回收率98.75％，RSD<10％，测定结果有效范围为25～500ng，检测周期1～2d。本专利技术测得烟酸的平均回收率为104％，RSD<5％，回收率、准确度与微生物法基本一致，但检出限更低(0.01～0.1ng/mL)，检测周期缩短至40min。Fan等利用HPLC-FLD技术检测茶叶中维生素B3和维生素B7的含量，检测限为2.22～2.56ng/mL，检测周期2h。Schmidt等使用HPLC法检测牛奶中维生素B6和维生素B2的含量，平均回收率为91.1％～111.2％、RSD≤6.7％，样本分离时间6min，检测周期45min，而本专利技术维生素B6含量平均回收率97％～108％、RSD<9.6％，维生素B2含量平均回收率为108％、RSD<17.5％。梁敏慧等利用UPLC-MS本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.快速检测猪肠道内容物/粪便中B族维生素含量的方法，其特征在于包括以下步骤：/n1)、样本前处理；/n称取猪200±10mg的盲肠内容物/粪便作为样本，加入750±50μL甲醇/乙腈/水溶液，匀质提取，得样品溶液；/n甲醇/乙腈/水溶液中，甲醇/乙腈/水＝2:2:1的体积比；/n2)、样品检测：/n将步骤1)前处理所得的样品溶液低温高速离心；取500μL上清液Ⅰ过Ostro磷脂去除板，氮气吹干；然后加入100μL 0.3％甲酸水溶液进行复溶，低温高速离心；所得的上清液Ⅱ进行检测分析；/n3)、将上清液Ⅱ检测所得的峰面积带入对应的B族维生素标准曲线中，获得上清液Ⅱ中8种B族维生素含量，然后经过换算，得到样本中8种B族维生素含量；/n所述8种B族维生素为：维生素B

【技术特征摘要】
1.快速检测猪肠道内容物/粪便中B族维生素含量的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)、样本前处理；
称取猪200±10mg的盲肠内容物/粪便作为样本，加入750±50μL甲醇/乙腈/水溶液，匀质提取，得样品溶液；
甲醇/乙腈/水溶液中，甲醇/乙腈/水＝2:2:1的体积比；
2)、样品检测：
将步骤1)前处理所得的样品溶液低温高速离心；取500μL上清液Ⅰ过Ostro磷脂去除板，氮气吹干；然后加入100μL0.3％甲酸水溶液进行复溶，低温高速离心；所得的上清液Ⅱ进行检测分析；
3)、将上清液Ⅱ检测所得的峰面积带入对应的B族维生素标准曲线中，获得上清液Ⅱ中8种B族维生素含量，然后经过换算，得到样本中8种B族维生素含量；
所述8种B族维生素为：维生素B1、维生素B2、烟酸、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、维生素B9、维生素B12。


2.根据权利要求1所述的快速检测猪肠道内容物/粪便中B族维生素含量的方法，其特征在于检测分析：
超高效液相色谱为：
采用WatersACQUITYUPLCI-Class系统进行分离；
色谱柱：Waters，HSST3；柱温：45℃；流动相：A液为0.3％(体积％)甲酸水溶液，B液为甲醇；
进样流速为300μL/min，进样量为5μL；
液相梯度如下：0～2.0min，B液为0；2.0～3.0min，B液从0线性变化到50％；3.0～4.5min，B液从50％线性变化到100％；4.5～5.5min，B液从100％线性变化到0；5.5～11min，B液为0；上述％为体积％；

【专利技术属性】
技术研发人员：易宏波，蒋宗勇，王丽，陈一波，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物科学研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44