含用于纯化芳基硫酸酯酶A的方法技术

本发明专利技术尤其提供了用于纯化重组产生以用于酶替代疗法的芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白的改良方法。本发明专利技术部分基于出人意料的发现：使用包括仅仅四个色谱柱和色谱柱后超滤/渗滤仅一个步骤的工艺，重组ASA蛋白可从未经处理的生物材料(例如，含有ASA的细胞培养基)中纯化。

【技术实现步骤摘要】
含用于纯化芳基硫酸酯酶A的方法相关申请的交叉引用本申请是申请号为201480003307.5、申请日为2014年1月9日、专利技术名称为“含用于纯化芳基硫酸酯酶A的方法”的中国专利技术专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2014/010856的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2013年1月9日，申请号为61/750,693的美国临时专利申请的优先权。上述申请通过引用特此整体并入。背景异染性脑白质营养不良疾病(MetachromaticLeukodystrophyDisease，MLD)是由酶芳基硫酸酯酶A(ASA)缺乏引起的常染色体隐性疾患。人体中通过ARSA基团编码的ASA是一种将脑苷脂-3-硫酸酯或鞘脂-3-O-硫酸半乳糖基酰基鞘氨醇(硫苷脂)分解为脑苷脂和硫酸盐的酶。在缺乏酶的情况下，硫苷脂累积在神经系统(例如，髓鞘、神经元和胶质细胞)中，而在内脏中累积程度较少。这些分子和细胞活动的结果是在CNS和PNS内进行性脱髓鞘和轴突缺失，其临床上伴随着严重的运动和认知功能障碍。该疾患的最典型临床特征是中枢神经系统(CNS)退化，它导致认知缺损(尤其例如智力迟钝、精神错乱、失明)。MLD本身能在幼儿中出现(婴儿后期形式)，其中出生刚满一周岁(例如，在约15-24月)之后的受感染儿童通常开始显现症状，而且他们通常不会存活超过5岁。MLD本身能在儿童中出现(少年形式)，其中年龄约在3-10岁的受感染儿童通常显示认知缺损，而寿命可变化(例如，在症状发作之后10-15年的范围)。MLD本身能在成年人中出现(成年发作形式)，并且能出现任何年龄的个体中(例如，通常在16岁和更大岁数)，而且疾病的进展可变化很大。酶替代疗法(ERT)是用于治疗MLD的改善的疗法，其包括向具有MLD的患者施用外源性替代ASA酶，特别是重组芳基硫酸酯酶A(rASA)(例如，重组人芳基硫酸酯酶A(rhASA))。概述本专利技术尤其提供用于纯化重组产生、用于酶替代疗法的ASA蛋白的改良方法。本专利技术部分基于出人意料的发现：使用包括色谱柱后超滤/渗滤仅一个步骤的工艺，重组ASA蛋白可从未经处理的生物材料(例如，含有ASA的细胞培养基)中纯化，得到直接进入最终配制缓冲液的药学上可接受的药用物质。如在以下实施例中所描述，通过简单合并色谱步骤的洗脱液和调节合并的洗脱液的pH到约6.0来完成该单一步骤UF/DF工艺。在本专利技术之前，用于纯化重组产生的rASA蛋白的工艺包括色谱柱后超滤/渗滤(UF/DF)至少两个步骤。如在实施例部分所描述，与使用多个UF/DF步骤纯化的重组ASA蛋白相比，根据本专利技术使用一步骤UF/DF工艺纯化的重组ASA蛋白具有可比较的纯度、活性和产率。例如，根据本专利技术纯化的重组ASA酶仅具有100pg/mg宿主细胞(HostCell)DNA，且保持高比活性(例如，约50-140U/mg)，其他区别特征还在于可提高重组ASA蛋白的生物利用度和/或溶酶体靶向。因此，该简化工艺在纯化重组ASA蛋白中更快速、更便宜、且同等有效。当联合高装载容量色谱步骤时，该工艺特别适用，从而便于重组ASA蛋白的大规模生产。因此，一方面，本专利技术提供纯化重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白的方法，该方法包括以下步骤：通过进行一个或多个色谱步骤由不纯制品中纯化所述重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白；合并来自所述一个或多个色谱步骤的洗脱液；调节所述合并的洗脱液的pH到约5.8、5.9或6.0或大于约5.8、5.9或6.0；和使所述经调节pH的洗脱液进行超滤和/或渗滤。在一些实施方案中，将所述pH调节到约5.8-7.0(例如，约5.8-6.8、约5.8-6.6、约5.8-6.4、约5.8-6.2、约5.8-6.1、约5.8-6.0、约5.9-7.0、约5.9-6.8、约5.9-6.6、约5.9-6.4、约5.9-6.2、约5.9-6.1、约5.9-6.0、约5.95-6.20、约5.95-6.15、约5.95-6.10或约5.95-6.05)。在一些实施方案中，将所述pH调节到约6.0。在一些实施方案中，使用pH7.0的包含磷酸钠、氯化钠和柠檬酸钠的缓冲液来调节所述pH。在一些实施方案中，所述缓冲液包含约0.1-0.5M(例如，约0.1-0.4M、0.1-0.3M、0.2-0.4M或0.2-0.3M)磷酸钠、约0.5-2.5M(例如，约0.5-2.0M、0.5-1.5M、0.75-2.5M、0.75-2.0M、0.75-1.5M、1.0-2.5M、1.0-2.0M或1.0-1.5M)氯化钠和约0.1-0.6M(例如，约0.1-0.5M、0.1-0.4M、0.2-0.5M、0.2-0.4M、0.3-0.5M或0.3-0.4M)柠檬酸钠，所述缓冲液的pH为约7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。在一些实施方案中，所述缓冲液包含约0.25M磷酸钠、约1.33M氯化钠和约0.34M柠檬酸钠，所述缓冲液的pH为约7.0。在一些实施方案中，在所述超滤和渗滤步骤之前进行病毒过滤。在一些实施方案中，进行所述超滤和/或渗滤的单一步骤。在一些实施方案中，所述超滤和/或渗滤的单一步骤仅包括一次渗滤。在各个实施方案中，所述超滤为切向流超滤。在一些实施方案中，所述一个或多个色谱步骤包括阳离子交换色谱。在一些实施方案中，所述阳离子交换色谱是最后的色谱步骤以及在调节pH之前合并所述阳离子交换色谱的洗脱液。在一些实施方案中，在进行所述阳离子交换色谱之前进行阴离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱中的一种或多种。在一些实施方案中，所述一个或多个色谱步骤包括亲和色谱。在一些实施方案中，所述亲和色谱为第一色谱步骤。在一些实施方案中，所述亲和色谱是最后的色谱步骤以及在调节pH之前合并所述亲和色谱的洗脱液。在一些实施方案中，在进行所述亲和色谱之前进行阴离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱中的一种或多种。在一些实施方案中，在进行所述亲和色谱之后进行阴离子交换色谱、混合模式色谱和疏水相互作用色谱的一种或多种。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱为Q色谱。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱包括TMAE树脂(例如，TMAE)。在一些实施方案中，一旦装载不纯制品，则使用pH约7.0、包含MES-Tris的第一洗涤缓冲液来洗涤所述TMAE树脂。在某些实施方案中，所述第一洗涤缓冲液包含约20-75mMMES-Tris(例如，约30-60mM、40-70mM或40-60mM)。在某些实施方案中，所述第一洗涤缓冲液包含约20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM或75mMMES-Tris。在一些实施方案中，使用pH约7.0、包含MES-Tris和NaCl的第二洗涤缓冲液来洗涤所述TMAE树脂。在一些实施方案中，所述第二洗涤缓冲液包含约5-75mMMES-Tris(例如，约5-70mM、5-60mM、5-50mM、5-40mM、5-30mM、10-60mM、10-50mM、10-40mM、10-30m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种纯化重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白的方法，所述方法包括/n通过进行一个或多个色谱步骤从不纯制品中纯化重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白；/n合并来自所述一个或多个色谱步骤的洗脱液；/n调节合并的洗脱液的pH到约6.0或大于约6.0的pH；和/n对经调节pH的洗脱液进行超滤和/或渗滤。/n

【技术特征摘要】
20130109 US 61/750,6931.一种纯化重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白的方法，所述方法包括
通过进行一个或多个色谱步骤从不纯制品中纯化重组芳基硫酸酯酶A(ASA)蛋白；
合并来自所述一个或多个色谱步骤的洗脱液；
调节合并的洗脱液的pH到约6.0或大于约6.0的pH；和
对经调节pH的洗脱液进行超滤和/或渗滤。


2.权利要求1所述的方法，其中将所述pH调节到约6.0。


3.权利要求1或2所述的方法，其中使用pH7.0的包含磷酸钠、氯化钠和柠檬酸钠的缓冲液来调节所述pH。


4.权利要求3所述的方法，其中所述缓冲液包含约0.1-0.5M磷酸钠、0...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·尼科尔斯，I·基农尼斯·加西亚，B·L·郑，M·H·蒋，
申请(专利权)人：夏尔人类遗传性治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US