一种检测血清异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片制造技术

本实用新型专利技术涉及一种检测血清异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片，属于蛋白检测技术。其特征在于：所述蛋白芯片的基质载片上设置有多个检测亚区，每个所述检测亚区用于检测一份血清样品；所述每个所检测亚区内设置有检测斑区域和对照斑区域，所述检测斑区域有通过喷涂微量DCP特异性抗体形成的检测斑，所述对照斑区域有通过喷涂牛血清白蛋白形成的对照斑；同一个检测斑区域内的所有检测斑上的物质的浓度相同；形成每一个所述检测斑的DCP特异性抗体的总量为3‑5nL,浓度为3‑5mg/ml，每个检测斑通过非接触式点样仪分6‑10次，每次喷涂300‑500pL的方式形成，检测斑直径为0.5‑1mm；本实用新型专利技术的蛋白芯片，试剂盒可准确地检测异常脱羧凝血酶原，临床使用中，具有灵敏度高、省时、便捷、经济等优点。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种检测血清异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片
本专利技术涉及蛋白检测技术，特别涉及一种检测血清异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片。
技术介绍
脱-r-羧基凝血酶原(Des--carboxy-prothrombin,DCP)是肝细胞癌产生的异常凝血酶原，与正常凝血酶原相比，DCP的分子结构特点是其丙氨酸结构域(Gladomain)中的一个或者多个谷氨酸(Glu)残基没有被完全羧化成为Gla,从而失去凝血功能。正常的凝血酶原是在肝细胞微粒体内，主要依赖维生素K的γ谷氨酰羧化酶及辅酶和VitaminKreductase参与下，将结构GlaDomain中的第6,7,14,16,19,20,25,26,29和32位的10个Glu残基羧化为Gla,成为有活性的凝血酶原，上述任何一位点或多位点的Glu残基羧化不全，都可形成DCP,使凝血酶原失去凝血功能。研究表明，原发性肝癌血清中的DCP明显升高。陆枫林等人发表的《去γ-羧基凝血酶原对原发性肝细胞癌的诊断价值》中国肿瘤临床2009年07期，其揭示，DCP值与肿瘤大小呈正相关关系。因此，准确监测血清中DCP水平对于临床医生判断预后、选择治疗方案以及观测疗效具有重要意义。由于临床检测中，对于医院，每天需要检测大量的样本，高通量芯片检测可大幅度提高检测效率。即低成本、快速高效、准确、高通量检测手段是最好的选择，但是目前没有关于高通量检测DCP的报道。现有检测方法中检测血清DCP的方法有:电化学发光免疫分析技术、液相亲和免疫方法、免疫沉淀法、westernblot、ELISA等。本领域技术人员知道，临床血清非常复杂，不仅仅包含其它肝癌的其它标志物，而且由于血清中DCP非常低，待测血清DCP受多种非特异物理吸附或者非特异结合的影响，比如凝血素、凝血酶和纤维素及其类似物等的干扰较大。因此，为了保证检测结果的准确性，灵敏性和特异性，上述采用免疫原理的检测方法中，都有一个共同的特点，即每个检测反应所采用的血清量少则50-100ul，多则3-5ml，对应地，每个检测就需要大量抗体完成，例如CN101377505A中公开的微孔板化学发光免疫分析测定方法，每孔中需要加入含有DCP抗体的包被液150ul，所需血清样品量需要50ul，而且，虽然该文件中公开其最低检测限可达到4.37mAU/ml，但是其记载的实验中并未采用真正的临床血清来验证其检测特异性和准确性，其检测数据来自于正常血清中加入标准品而得的人工样品。而且这些方法的检测时间长达3-4小时，由于依据这些方法，做成高通量芯片的话，用于每个样品的检测斑或捕获斑的尺寸将会做得很大，成本非常高，失去了做成集成芯片的意义，即无法实现高通量及低成本的目的，在门诊中普及并不现实。实现DCP高通量检测，需要进行更多探索。
技术实现思路
本技术基于蛋白芯片领域在检测血清DCP的空白，提供了一种适合于检测血清中DCP的高通量蛋白芯片、试剂盒及其制备方法，在保证检测准确性，灵敏性和特异性的前提下，最大限度地节省了抗体、血清用量，适合于临床使用，具有省时、经济、准确、便捷的优点。本技术的技术方案如下：本技术一方面提供一种检测血清异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片，其特征在于：所述蛋白芯片的基质载片上设置多个检测亚区，每个所述检测亚区用于检测一份血清样品；所述每个所检测亚区内设置有检测斑区域和对照斑区域，所述检测斑区域有通过喷涂微量DCP特异性抗体形成的检测斑，所述对照斑区域内有通过喷涂牛血清白蛋白形成的对照斑；同一个检测斑区域内的所有检测斑上的物质的浓度相同；形成每一个所述检测斑的DCP特异性抗体的总量为3-5L,浓度为3-5mg/mL，每个检测斑通过非接触式点样仪分6-10次，喷涂300-500pL的方式形成，检测斑直径为0.5-1mm。优选地，每个所述检测斑区域包括排列成1排的4-8个相互分隔的检测斑，所述对照斑区域包括排列成1排的4-8个相互独立分隔的对照斑；所述检测斑和对照斑排成平行的两列。优选地，芯片的长、宽、厚度为76.4mm、25.2mm、1mm，所述基质载片上设置10个所述检测亚区。优选地，所述检测亚区之间设置有凸起作为物理隔断。优选地，所述DCP的特异性单克隆抗体为鼠抗人DCP。本技术另一方面提供一种用于检测异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片的制备方法，其特征在于：用于形成每一个所述检测斑的DCP特异性抗体的总量为3nl,浓度为4mg/ml，所述DCP特异性抗体分6-10次喷涂且每次喷涂300-500pl形成一个所述检测斑，检测斑直径为0.5-1mm。优选地，上述制备方法中，喷涂过程中采用的所述DCP特异性抗体的温度为4-8摄氏度。优选地，采用非接触式点样仪进行喷涂点样。本技术基于上述蛋白芯片，还提供一种检测血清异常脱羧凝血酶原的试剂盒，其特征在于：包括上述任一蛋白芯片，以及HRP标记的凝血酶原多克隆抗体，HRP化学发光底物液；所述HRP标记的凝血酶原多克隆抗体为兔源抗体，与所述检测斑上固定的DCP特异性抗体来源于不同物种。一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的方法，其特征在于：采用上述任一蛋白芯片，且包括如下步骤：将待测血清样本稀释后滴加在所述蛋白芯片的检测亚区上，孵育后，用PBST洗涤检测亚区，去除非特异结合物；加入用PBS稀释的HRP标记的凝血酶原抗体,孵育后，用PBST洗涤，去除非特异结合物；加入HRP底物发光液，用化学发光扫描仪对蛋白芯片进行扫描，分别得到稀释后待测血清样本中的DCP发光像素值；所述孵育指37℃孵育30分钟。本技术提供一种检测DCP的化学发光蛋白芯片，基于抗体抗原抗体夹心反应原理及化学发光原理，将DCP特异性抗体喷涂在芯片载片上形成检测斑，用于结合血清中的DCP(凝血酶原的异常脱羧部位)，同时设置有对照斑点。专利技术人发现，按照常规免疫原理的检测方法，将捕捉抗体包被在芯片基质载片上，每个检测斑10ul，浓度4mg/ml(检测斑直径在5-10mm)，采用血清中添加系列梯度浓度标准品溶液(标准品血清0mAU/ml、5mAU/ml、10mAU/ml，20mAU/ml、40mAU/ml80mAU/ml、160mAU/ml、320mAU/ml、640mAU/ml)作为检测样品，制作标准曲线，每个检测亚区滴加50ul血清标准品，用PBST洗涤检测亚区，去除非特异结合物；加入用PBS稀释的HRP标记的凝血酶原抗体,孵育后，用PBST洗涤，去除非特异结合物；加入HRP底物发光液，用化学发光扫描仪对蛋白芯片进行扫描获得像素值。以标准品血清的浓度为横坐标，像素值为纵坐标，绘制标准曲线，并生成标准曲线回归方程，但是，结果显示，标准曲线回归方程的相关系数偏低，多次重复，R2值都在0.6-0.7之间，说明芯片的检测准确性不稳定，受到干扰较多。采用配制的另一批不同浓度的检验标准品血清验证标准曲线，得出的结果与检验标准品血清本身浓度相差悬殊，而且其中浓度低于80mAU/ml的检验标准品血清的检测数值多次重本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测血清异常脱羧凝血酶原的高通量蛋白芯片，其特征在于：/n所述蛋白芯片的基质载片上设置有多个检测亚区，每个所述检测亚区用于检测一份血清样品；所述每个所检测亚区内设置有检测斑区域和对照斑区域，所述检测斑区域有通过喷涂微量DCP特异性抗体形成的检测斑，所述对照斑区域有通过喷涂牛血清白蛋白形成的对照斑；同一个检测斑区域内的所有检测斑上的物质的浓度相同；/n形成每一个所述检测斑的DCP特异性抗体的总量为3-5nL,浓度为3-5mg/ml，每个检测斑通过非接触式点样仪分6-10次，每次喷涂300-500pL的方式形成，检测斑直径为0.5-1mm。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20160701 CN 201610515896.61.一种检测血清异常脱羧凝血酶原的高通量蛋白芯片，其特征在于：
所述蛋白芯片的基质载片上设置有多个检测亚区，每个所述检测亚区用于检测一份血清样品；所述每个所检测亚区内设置有检测斑区域和对照斑区域，所述检测斑区域有通过喷涂微量DCP特异性抗体形成的检测斑，所述对照斑区域有通过喷涂牛血清白蛋白形成的对照斑；同一个检测斑区域内的所有检测斑上的物质的浓度相同；
形成每一个所述检测斑的DCP特异性抗体的总量为3-5nL,浓度为3-5mg/ml，每个检测斑通过非接触式点样仪分6-10次，每次喷涂300-500pL的方式形成，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张爱英，金荣华，李宁，王升启，柯杨，
申请(专利权)人：首都医科大学附属北京佑安医院北京市性病艾滋病临床治疗中心，北京市肝病研究所，北京厚德天承生物科技有限公司，
类型：新型
国别省市：北京;11