用于在植物中生产重组蛋白的复制和非复制载体及其使用方法技术

本公开涉及基于植物的重组蛋白生产系统及其生产方法和用途。基于植物的重组蛋白生产系统是包含5'UTR和3'UTR的载体，其中3'UTR包含至少一个选自以下的终止子：EU、IEU、NbACT3、NbACT617、NbACT567、Pin2、BDB501、BDB282、NbHSP、NbHSPb、Rep、RbcS、SIR、SIR 5'/3'、SIR 3'、AtHSP、35S、RepA、NOS、TMV、TNVD、PEMV和BYDV。在某些实施方案中，载体在3'UTR中包含两个终止子，其中两个终止子融合形成双终止子。例如，双终止子包含两个选自以下的成员：EU、IEU、NbACT3、NbACT617、NbACT567、Pin2、BDB501、BDB282、NbHSP、NbHSPb、Rep、RbcS、SIR、SIR 5'/3'、SIR 3'、AtHSP、35S、RepA、NOS、TMV、TNVD、PEMV和BYDV。在一些方面，载体还包含在终止子下游的染色质支架/基质附着区域(MAR)。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在植物中生产重组蛋白的复制和非复制载体及其使用方法相关申请的交叉引用本申请要求2018年3月2日提交的美国临时专利申请号62/638,010的权益，并且将临时申请的公开内容通过引用并入本文。通过引用并入电子提交的材料同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表通过引用将其全部内容并入本文，并标识如下：于2019年3月1日创建的一个名为“序列表(SeqList)”的104,506字节ASCII(文本)文件。
本公开涉及基于植物的重组蛋白生产系统及其生产方法和用途。
技术介绍
基于植物的重组蛋白生产系统已成为传统哺乳动物和微生物细胞培养系统的有前途的替代品，由于其具有成本低、可扩展性高(scalability)和改善的安全性的独特优势(Chen和Davis2016；Kamarova等人，2010)。案例研究表明，与传统方法相比，有可能大幅度降低资本投资成本和植物制治疗剂的商品成本(Tusé等人，2014；Nandi等人，2016)。这些系统具有快速安全地生产治疗剂的能力，这在两个成功案例中得到了证明：FDA批准了针对戈谢氏(Gaucher’s)疾病的酶替代疗法，这成为了第一种植物制治疗剂(Zimran等人，2011；Fox2012)；以及在2014年埃博拉疫情爆发期间给予的单克隆抗体疗法ZMapp，已证明其可以抵抗致命的病毒攻击(Lyon等人，2014；Qui等人，2014)。已经探索了许多改善在植物中生产蛋白的策略，例如病毒表达系统、亚细胞靶向、农杆菌菌株、表达宿主、启动子、内含子和5'非翻译区(UTR)。但是，在很多这些系统中的另一关键成分是基因终止子和周围区域，其尚未进行系统优化。
技术实现思路
本公开涉及基于植物的重组蛋白生产系统。一方面，基于植物的重组蛋白生产系统是包含至少一个表达盒的植物表达载体。在一些方面，本公开涉及可以在本文公开的表达盒中使用的3'UTR。至少一个表达盒包含5'UTR和3'UTR，其中3'UTR包含第一终止子；以及第二终止子，染色质支架/基质附着区域(MAR)，或两者兼有。在一些实施方案中，第一终止子和第二终止子形成双终止子。在一些实施方案中，3′UTR还包含MAR。在某些方面，MAR在双终止子的下游，而在其他方面，MAR在第一终止子的下游。在某些实施方式中，双终止子增加了来自表达盒的蛋白表达。在一些实施方案中，第一终止子是无内含子烟草延伸蛋白(extension)终止子(EU)，以及第二终止子选自：本氏烟草(Nicotianabenthamiana)肌动蛋白3'UTR(NbACT3)、番茄丛矮(stunt)病毒RNA沉默的p19抑制子(P19)、本氏烟草18.8kDaII类热休克蛋白3'UTR(NbHSP)、豆黄矮病毒的短基因间隔区域(SIR)、农杆菌胭脂碱合酶3'UTR(NOS)、花椰菜花叶病毒35S3'UTR(35S)、烟草花叶病毒3'UTR(TMV)、BDB501(豆矮花叶病毒DNAB核穿梭蛋白3'UTR、基因间隔区域、运动蛋白的3'末端和运动蛋白序列下游附加的200nt)、烟草坏死病毒D3'UTR(TNVD)、豌豆耳突(enation)花叶病毒3'UTR(PEMV)和大麦黄矮病毒3'UTR(BYDV)。在某些方面，EU位于第二终止子的上游。在一些实施方案中，当第二终止子是35S时，35S在EU的上游。在一些实施方案中，第一终止子是包含内含子的烟草延伸蛋白终止子(IEU)，以及第二终止子选自：SIR，35S和豆黄矮病毒的长基因间隔区域(LIR)。在某些方面，IEU在第二终止子的上游。在一些实施方案中，至少一个表达盒包含5'UTR和3'UTR，其中3'UTR包含第一终止子和MAR。在某些方面，3'UTR包含EU以及MAR，其中MAR选自：Rb7和TM6。在其他方面，3'UTR包含IEU和选自以下的MAR：Rb7和TM6。在某些实施方案中，至少一个表达盒的3'UTR包含第一终止子、第二终止子和MAR。在一个实施方案中，3’UTR包含IEU、35S和Rb7，其中IEU在35S的上游。在其他实施方案中，3’UTR包含EU。在一方面，这种3’UTR包含EU、35S和Rb7，其中EU在35S的下游或上游。在另一方面，这种3′UTR包含EU、NbACT3和Rb7，其中EU在NbACT3的上游。在另一方面，这种3’UTR包含EU、BD501和Rb7，其中EU在BD501的上游。在另一方面，这种3′UTR包含EU、拟南芥(A.thaliana)热休克蛋白3′UTR(AtHSP)和Rb7，其中EU在AtHSP的下游。在另一方面，这种3’UTR包含EU、35S和TM6，其中EU在35S的上游。在另一个实施方案中，植物表达载体包含具有3'UTR的表达盒，所述表达盒包含至少一个选自以下的终止子：EU、IEU、NbACT3、NbACT617(NbACT3的下游617-nt区域)、NbACT567(NbACT3的下游567nt)、Pin2、BDB501、BDB282(包含豆矮花叶病毒DNAB核穿梭蛋白3'UTR的282个核苷酸、基因间隔区域、以及运动蛋白的3’末端)、NbHSP、NbHSPb(NbHSP在5’末端缺失75nt)、豆矮花叶病毒rep基因3'UTR(Rep)、豌豆二磷酸核酮糖羧化酶小亚基3'UTR(RbcS)、SIR、SIR5’/3’(在上游和下游具有附加序列的SIR)、SIR3'(具有附加的下游病毒序列的SIR)、AtHSP、35S、豆矮花叶病毒repA基因3'UTR(RepA)、NOS、TMV、TNVD、PEMV和BYDV。在某些方面，3'UTR包含至少一个选自以下的终止子：NbACT3、NbACT617、NbACT567、Pin2、BDB501、BDB282、NbHSP、NbHSPb、Rep、RbcS、SIR、SIR5’/3’、SIR3'、AtHSP和RepA。在某些实施方式中，3'UTR包含双终止子，其中双终止子是选自以下的两个成员的融合：EU、IEU、NbACT3、NbACT617、NbACT567、Pin2、BDB501、BDB282、NbHSP、NbHSPb、Rep、RbcS、SIR、SIR5’/3’、SIR3'、AtHSP、35S、RepA、NOS、TMV、TNVD、PEMV和BYDV。例如，3'UTR包含一个双终止子，其中双终止子是选自以下的两个成员的融合：EU、IEU、NbACT3、NbACT617、NbACT567、Pin2、BDB501、BDB282、NbHSP、NbHSPb、Rep、RbcS、SIR、SIR5’/3’、SIR3'、AtHSP、35S、RepA、NOS、TMV、TNVD、PEMV和BYDV。在某些方面、3'UTR包含EU和选自以下的第二终止子：NbACT、P19、NbHSP、SIR、NOS、35S、TMV、BDB501、TNVD、PEMV和BYDV，其中在某些实施方案中EU在第二终止子的上游。在其他方面，3'UTR包含35S和选自以下的第二终止子：NbACT3、NOS、EU、NbHSP、Pin本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物表达载体，其包含表达盒，其中所述表达盒包含5′UTR和3′UTR，其中所述3′UTR含有：/n第一终止子；以及/n第二终止子、染色质支架/基质附着区域(MAR)、或两者都有。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180302 US 62/638,0101.一种植物表达载体，其包含表达盒，其中所述表达盒包含5′UTR和3′UTR，其中所述3′UTR含有：
第一终止子；以及
第二终止子、染色质支架/基质附着区域(MAR)、或两者都有。


2.根据权利要求1所述的植物表达载体，其中所述第一终止子和第二终止子形成双终止子。


3.根据权利要求2所述的植物表达载体，其中所述3’UTR在所述双终止子的下游还包含MAR。


4.根据权利要求1所述的植物表达载体，其中所述3’UTR包含MAR。


5.根据权利要求4所述的植物表达载体，其中所述双终止子增加来自所述表达盒的蛋白表达。


6.根据权利要求1所述的植物表达载体，其中所述第一终止子是无内含子烟草延伸蛋白终止子(EU)，以及所述第二终止子选自：本氏烟草(Nicotianabenthamiana)肌动蛋白3'UTR(NbACT3)、来自番茄丛矮病毒的RNA沉默的p19抑制子(P19)、本氏烟草18.8kDaII类热休克蛋白3'UTR(NbHSP)、豆黄矮病毒的短基因间隔区域(SIR)、农杆菌胭脂碱合酶3'UTR(NOS)、花椰菜花叶病毒35S3'UTR(35S)、烟草花叶病毒3'UTR(TMV)、BDB501(豆矮花叶病毒DNAB核穿梭蛋白3'UTR、基因间隔区域、运动蛋白的3'末端、以及运动蛋白序列下游附加的200nt)、烟草坏死病毒D3'UTR(TNVD)、豌豆耳突花叶病毒3'UTR(PEMY)和大麦黄矮病毒3'UTR(BYDV)。


7.根据权利要求6所述的植物表达载体，其中EU在所述第二终止子的上游。


8.根据权利要求6所述的植物表达载体，其中所述3′UTR包含EU和35S，其中35S在EU的上游。


9.根据权利要求1所述的植物表达载体，其中所述第一终止子是含内含子的烟草延伸蛋白终止子(IEU)，以及所述第二终止子选自：SIR、35S和豆黄矮病毒的长基因间隔区域(LIR)。


10.根据权利要求9所述的植物表达载体，其中IEU在所述第二终止子上游。


11.根据权利要求1所述的植物表达载体，其中所述3’UTR包含EU和MAR，其中MAR选自：Rb7和TM6。


12.根据权利要求1所述的植物表达载体，其中所述3’UTR包含IEU和MAR，其中MAR选自：Rb7和TM6。


13.根据权利要求1所述的植物表达载体，其中所述3’UTR包含所述第一终止子、所述第二终止子和MAR。


14.根据权利要求13所述的植物表达载体，其中所述3′UTR包含所述第一终止子、所述第二终止子以及MAR的组合，其中所述第一终止子、所述第二终止子和MAR选自以下：
EU、35S和Rb7，其中EU在35S的下游或上游；
EU、NbACT3和Rb7，其中EU在NbACT3的上游；
EU、BD501和Rb7，其中EU在BD501的上游；
EU、拟南芥(A.thaliana)热休克蛋白3'UTR(AtHSP)和Rb7，其中EU在AtHSP的下游；
EU、35S和TM6，其中EU在35S的上游；以及
IEU、35S和Rb7，其中IEU在35S的上游。


15.根据权利要求14所述的植物表达载体，其中所述植物表达载体的序列如SEQIDNO.115、SEQIDNO.116、或SEQIDNO.117所示。


16.一种包含表达盒的植物表达载体，其中所述表达盒包含5′UTR和3′UTR，其中所述3′UTR包含至少一个选自以下的终止子：EU、IEU、NbACT3、NbACT617(NbACT3的下游617-nt区域)、NbACT567(NbACT3的下游567nt)、Pin2、BDB501、BDB282(包含豆矮花叶病毒DNAB核穿梭蛋白3'UTR的282个核苷酸、基因间隔区域、以及运动蛋白的3’末端)、NbHSP、NbHSPb(NbHSP在5’末端缺失75nt)、豆矮花叶病毒rep基因3'UTR(Rep)、豌豆二磷酸核酮糖羧化酶小亚基3'UTR(RbcS)、SIR、SIR5'/3'(在上游和下游具有附加序列的SIR)、SIR3'(具有附加的下游病毒序列的SIR)、AtHSP、35S、豆矮花叶病毒repA基因3'UTR(RepA)、NOS、TMV、TNVD、PEMV和BYDV。


17.根据权利要求16所述的植物表达载体，其中所述3′UTR包含至少一个选自以下的终止子：NbACT3、NbACT617、NbACT567、Pin2、BDB501、BDB282、NbHSP、NbHSPb、Rep、RbcS、SIR、SIR5’/3’、SIR3'、AtHSP和RepA。


18.根据权利要求16所述的植物表达载体，其中所述3′UTR包含双终止子，其中所述双终止子是选自以下的两个成员的融合：EU、IEU、NbACT3、NbACT617、NbACT567、Pin2、BDB501、BDB282、NbHSP、NbHSPb、Rep、RbcS、SIR、SIR5’/3’、SIR3'、AtHSP、35S、RepA、NOS、TMV、TNVD、PEMV和BYDV。


19.根据权利要求16所述的植物表达载体，其中所述3′UTR包含EU和选自以下的第二终止子：NbACT、P19、NbHSP、SIR、NOS、35S、TMV、BDB501、TNVD、PEMV和BYDV。


20.根据权利要求19所述的植物表达载体，其中EU位于所述第二终止子的上游。


21.根据权利要求20所述的植物表达载体，其中所述植物表达载体的序列如SEQIDNO.115、SEQIDNO.116、或SEQIDNO.117所示。


22.根据权利要求19所述的植物表达载体，其中所述3′UTR包含35S和选自以下的第二终止子：NbACT3、NOS、EU、NbHSP、Pin2和BDB501。


23.根据权利要求21所述的植物表达载体，其中35S在所述第二终止子的上游。


24.根据权利要求21所述的植物表达载体，其中NOS在35S的上游。


25.根据权利要求16所述的植物表达载体，其中所述3'UTR包含IEU和选自以下的第二终止子：SIR、35S和LIR。

【专利技术属性】
技术研发人员：H·梅森，A·迪亚摩斯，S·H·罗森塔尔，
申请(专利权)人：亚利桑那州立大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US