用于无异种产生hMPC群的方法技术

本发明专利技术涉及产生骨骼肌来源的人肌前体细胞群的方法。出于该目的，使用了专用的不含FBS的细胞生长培养基。本发明专利技术还涉及包含这样的hMPC群的组合物，其用作药物，尤其是在骨骼肌功能障碍的治疗中的药物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于无异种产生hMPC群的方法
本专利技术涉及用于无异种产生人肌前体细胞(humanmuscleprecursorcell，hMPC)群的方法、包含这些hMPC的组合物、以及这些hMPC在产生用于治疗骨骼肌功能障碍，尤其是压力性尿失禁的组合物中的用途。
技术介绍
尿失禁(不自主的尿流失)是一个重要的医学问题，约一半的超过45岁女性群体以及17％的超过70岁男性受到影响。节制(continence)和排尿涉及尿道闭合与逼尿肌活动之间的平衡。通过尿道括约肌、膀胱颈位置、尿道平滑肌、神经完整性、血管丛和周围组织支持物的复杂相互作用来实现节制。存在不同类型的尿失禁，例如压力性尿失禁和急迫性尿失禁。压力性尿失禁(stressurinaryincontinence，SUI)是与咳嗽、笑、打喷嚏、锻炼或提高腹内压力并因此提高对膀胱的压力的与其他运动相关的少量尿的流失。由骨骼肌构成并因此在躯体神经系统的自主控制下的外横纹尿道括约肌主要负责防止SUI。对外尿道括约肌的损伤主要发生在分娩期间、手术治疗或因为衰老的作用。SUI是影响全世界超过2亿人的疾病，并且通常在女性中为在男性中的两倍，由于日常活动受限，使人不愉快的感觉、气味以及由湿尿布引起的感染而降低了患者的生活质量。招致的健康护理成本很高。SUI的当前治疗选择主要包括非手术治疗(膀胱训练、饮食调整)、药物治疗和手术治疗。这些治疗仅提供短期缓解，并且其总体成功经常受到并发症(手术的侵入性、对周围组织的损伤、导致泌尿系感染率提高)或副作用(药物、由不可降解生物材料引起的组织损伤，等)的限制。治疗尿失禁的细胞治疗方法的进展显示出使用患者自身的细胞来纠正潜在病因的有前景的结果。基于细胞的治疗的最新进展为在患有SUI的患者中恢复受损的括约肌功能提供了多种解决方案。US5,130,141公开了成肌细胞在小鼠中用于治疗肌无力的用途。更先进的肌再生方法是通过在有或无外源生长因子的情况下将成肌细胞并入到重建的基底膜的三维凝胶中(Barberoetal.，Growthfactorsupplementedmatrigelimprovesectopicskeletalmuscleformation-acelltherapyapproach，JCellPhysiol.2001Feb；186(2)：183-92)。在这些方案中，使用市售的由鼠肉瘤细胞分泌的胶状蛋白质混合物其包含高浓度的多种生长因子以促进成肌细胞的增殖和分化。US2014/0227233A1公开了用于通过注射“再生胶(regenerativeglue)”治疗SUI的方法，所述“再生胶”包含市售材料(包括生物相容性胶、(人纤维蛋白原和人凝血酶的)纤维蛋白胶或生物相容性凝胶)与来自骨髓或脂肪组织的间充质干细胞的组合。出于替代的目的，将该胶注射在受损、缺失或受伤的耻骨-尿道韧带的部位处。WO2016/138289A1公开了平滑肌前体细胞用于治疗平滑肌功能障碍的潜在用途。可注射的填充剂，例如特氟龙(Teflon)、牛胶原蛋白、硅酮颗粒和碳珠的使用已获得短期成功。然而，已报道这些填充剂可引起慢性炎症、异物巨细胞应答、尿道周围脓肿、尿道糜烂、下尿路梗阻及由此导致的尿潴留，和向内部器官的迁移、以及肺栓塞(KiilholmaP.etal.，ComplicationsofTefloninjectionsforstressurinaryincontinence，Neurourol.Urodyn12：131-137(1993))。已对作为用于遗传性和获得性肌病症的治疗的MPC移植进行了研究。MPC在其静息、非活化阶段作为卫星细胞位于肌纤维周围的基膜之下。这些细胞在受到创伤或损伤时成为活化的，并且通过向受伤区域迁移、增殖以及彼此融合形成肌管(最终成熟为肌纤维)而参与组织再生。大多数MPC致力于肌原性细胞谱系，并因此最适合于骨骼肌生物工程。MPC具有巨大的生长潜能，并且易于在培养中扩增。在肌管形成之后，这些细胞变为有丝分裂后期(post-mitotic)的并且开始分化为成熟纤维，从而抑制体内不受控制的组织生长。已在啮齿动物和犬模型中研究了可注射培养的MPC用于治疗SUI的潜在用途，并且其具有成为恢复括约肌功能的第一治疗的潜能(Yokohamaetal.，AutologousPrimaryMuscle-DerivedCellsTransferintotheLowerUrinaryTract；TissueEngineering，2001，7(4)，p.395-404；Yiouetal.，RestorationofFunctionalMotorUnitsinaRatModelofSphincterInjurybyMusclePrecursorCellAutografts，Transplantation，2003，76(7)：p.1053-60；Eberlietal.，Acaninemodelofirreversibleurethralsphincterinsufficiency.BJUInt，2009，103(2)：p.248-53)。然而，这些动物模型未充分反映见于人患者中的病症。迄今为止，肌来源的干细胞和自体成肌细胞注射一直为人中研究最多的选择。然而，尽管在过去数次尝试，但是尿道括约肌的再生治疗尚未到达临床，并且还不是日常泌尿外科实践的一部分。由于对胎牛血清(fetalbovineserum，FBS)的担忧，需要其替代物以有助于将该治疗转移到临床环境中。迄今为止，FBS是用于细胞培养和组织工程的标准培养基补充剂和生长因子的来源。在祖细胞的体外培养扩增期间使用FBS可能由于蛋白质和大分子而造成潜在危害。这些大分子在干细胞中的内化可传播病毒病/朊病毒病。此外，大分子用作移植细胞上的抗原底物并引起免疫反应。由于异种免疫(xeno-immunization)的风险，病原体的传播以及与FBS收集相关的伦理问题，迫切需要用于制造临床细胞治疗产品的合适的人替代物。因此，由于安全性和临床应用的其他担忧，FBS是不期望的。在一些调查研究中，已在用补充有FBS的细胞移植的患者中确定了过敏反应和其他变态反应。如应用于治疗方法中的任何药物一样，细胞产品也需要满足法规要求。其产生过程需要遵循良好操作规范(goodmanufacturingpractise，GMP)，以便使得能够在患者中安全应用。因此，从细胞培养基中去除任何动物补充剂代表了迈向将肌干细胞治疗临床转移到患有SUI的患者中的重要一步，从而避免了针对异种蛋白质的不良反应。细胞培养方法的这种改变应在不影响hMPC的主要特征(即其形成收缩肌组织的能力)的情况下实施。FBS的可能替代物为补充有人血清、人血小板衍生物、同种异体脐带血血清，或化学限定培养基的培养基。已将分别含有人血小板裂解物(humanplateletlysate，hPL)的细胞培养基或生长培养基描述为用于临床规模扩增间充质基质细胞或扩增人间充质干细胞以用于治疗应用的含FBS的培养基的可能替代物(Schallmoser本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.产生来源于骨骼肌的人肌前体细胞群的方法，其包括至少以下步骤：/n-通过人患者的骨骼肌活检物获得人组织样品；/n-从所述人组织样品手术移除脂肪组织和/或腱组织和/或结缔组织；/n-将人组织样品切碎并进行酶消化；/n-降低成纤维细胞的数目，从而产生人肌前体细胞群；/n-使所述人肌前体细胞在经胶原蛋白包被的皿中沉淀；/n-使所述人肌前体细胞在细胞生长培养基中扩增至少1代。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180508 EP 1817116231.产生来源于骨骼肌的人肌前体细胞群的方法，其包括至少以下步骤：
-通过人患者的骨骼肌活检物获得人组织样品；
-从所述人组织样品手术移除脂肪组织和/或腱组织和/或结缔组织；
-将人组织样品切碎并进行酶消化；
-降低成纤维细胞的数目，从而产生人肌前体细胞群；
-使所述人肌前体细胞在经胶原蛋白包被的皿中沉淀；
-使所述人肌前体细胞在细胞生长培养基中扩增至少1代。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述骨骼肌活检物从选自以下的组织获取：比目鱼肌、腹直肌、股四头肌、股外侧肌，其中所述骨骼肌活检物优选地从比目鱼肌组织获取。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将所述人肌前体细胞培养至少2代，优选3或4代。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用不含胎牛血清的细胞生长培养基扩增所述人肌前体细胞。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于使用包含人血小板裂解物，优选合并的经过滤人血小板裂解物的细胞生长培养基扩增所述人肌前体细胞，并且其中所述人血小板裂解物优选地以5％至20％，更优选7％至12％，最优选约10％的终浓度存在于所述细胞生长培养基中。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于用于扩增所述人肌前体细胞的细胞生长培养基还包含抗凝血因子，所述抗凝血因子优选肝素，更优选肝素Na，优选地终浓度为1至10IU/ml，更优选2至6IU/ml，最优选约2IU/ml，并且其中所述细胞生长培养基优选地另外包含以下成分：
-营养液，优选DMEM，更优选1∶1DMEM/F12营养混合物；
-hEGF，优选终浓度为5至20ng/ml，更优选为约10ng/ml；
-hbFGF，优选终浓度为0.5至2ng/ml，更优选为约1ng/ml；
-胰岛素，优选人胰岛素，优选终浓度为5至20μg/ml，更优选为约10μg/ml；
-地塞米松，优选终浓度为0.2至0.8μg/ml，更优选为约0.4μg/ml。


7.骨骼肌来源的人肌前体细胞群，其优选地表达Pax7、结蛋白和α-辅肌动蛋白，优选还表达MyHC，所述群已在根据权利要求1至6中之一所述的方法中产生。


8.在根据权利要求1至6中之一所述的方法中产生的骨骼肌来源的人肌前体细胞群，其用作药物。


9.骨骼肌来源的人肌前体细胞群，其优选地在根据权利要求1至6中之一所述的方法中产生，其用于治疗骨骼肌功能障碍。


10.骨骼肌来源的人肌前体细胞群，其优选地在根据权利要求1至6中之一所述的方法中产生，其用于治疗压力性尿失禁。


11.用于产生用于治疗骨骼肌功能障碍的人肌前体细胞群的细胞生长培养基，其中所述细胞生长培养基不含胎牛血清。


12.根据权利要求11所述的细胞生长培养基，其中所述细胞生长培养基包含人血小板裂解物，优选合并的人血小板裂解物。


13.根据权利要求12所...

【专利技术属性】
技术研发人员：丹尼尔·埃拜尔利，德亚娜·莫尔，苏赞·萨莱米，法赫德·阿扎比·佐拉克，
申请(专利权)人：苏黎士大学，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH