一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒，包括抗FITC抗体包被板、FITC标记新型冠状病毒抗原、碱性磷酸酶或辣根过氧化酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体。本发明专利技术采用鼠抗人IgA单克隆抗体作为二抗，可与免疫球蛋白α链特异性反应，与IgG、IgM无交叉反应，极大的提高检测试剂盒的特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒
本专利技术属于免疫分析检测
，尤其是涉及一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒。
技术介绍
由SARS-Cov-2引起的新型冠状病毒，已引起全球范围内的大流行，造成全球超过1100万人感染，死亡人数超过50万，死亡率高达12％以上。疫情很快扩展到全球123个国家和地区，基于该病毒严重的发病率和死亡率，荧光定量PCR检测病毒RNA是目前公认的检测标准，但是，检测的灵敏度很大程度依赖于采样位置、感染时间以及病毒载量。另外，CT(胸部断层扫描)有助于疾病诊断，并可与RT-PCR检测进行互补，但是缺乏特异性。与实验室标准的分子检测水平相比较，血清学的检测方法易于执行，可作为一种辅助诊断工具，并且有助于提高检测的灵敏度，尤其对于晚期并发症患者。目前很多血清学检测方法已经发展成为商业化的试剂盒，例如：酶联免疫吸附测定、磁微粒化学发光、胶体金检测，鉴于分子诊断灵敏度低的特点，血清学检测可用于急性感染中RT-PCR检测阴性的患者，也可用于流行病学的研究。冠状病毒其基因组编码的结构蛋白有四种，分别为：S蛋白(刺突蛋白)、N蛋白(核衣壳蛋白)、E蛋白(膜蛋白)、M蛋白(基质蛋白)。在这四种结构蛋白中，S蛋白和N蛋白是主要的免疫原性蛋白，我们目前开发的化学发光的检测方法主要针对S蛋白，S蛋白还有两个亚基，S1和S2，S1主要包含受体结合域(RBD)，负责识别细胞表面受体ACE2。基于新冠S蛋白受体结合域RBD作为诊断抗原，具有更高的检测灵敏度和特异性。在动物模型中，动物机体感染SARS-Cov-2后，肺中高滴度的粘膜IgA可减轻肺部病变。IgA抗体与SARS-Cov-2的受体结合域RBD有高度亲和力，可通与细胞表面的ACE2竞争性作用从而阻断RBD与受体的结合，免疫球蛋白IgM和IgA是人类免疫系统自然产生的抗体，在传统的IgM和IgG两种抗体指标的基础上，增加对IgA的检测，能够有效提高抗体诊断的特异性和灵敏度。由于IgA复杂的多聚体结构，IgA的粘膜亲和力增强了抗原与抗体的结合。另外，IgA抗体高水平的糖基化程度又可进一步保护粘膜表面的非特异性干扰，在SARS-Cov-2感染中发挥中和抗体的关键作用。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术旨在提出一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒，以克服现有技术中的不足，本专利技术采用鼠抗人IgA单克隆抗体作为二抗，可与免疫球蛋白α链特异性反应，与IgG、IgM无交叉反应，极大的提高检测试剂盒的特异性。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒，包括抗FITC抗体包被板、FITC标记新型冠状病毒抗原、碱性磷酸酶或辣根过氧化酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体。优选的，FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原为S-RBD蛋白。优选的，还包括稀释液，稀释液包括如下组分Tris5-10g/L；NaCl10-20g/L；BSA6-20g/L；海藻糖5-20g/L；Tween-200.5-5mL/L；ProClinTM3000.5-2mL/L；硫酸庆大霉素1-5mL/L，且pH为8.0±0.2。优选的，FITC标记新型冠状病毒抗原、碱性磷酸酶或辣根过氧化酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体的工作浓度分别为0.5～5μg/mL。优选的，碱性磷酸酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体的制备方法，1)配制5-20mg/mLALP溶液；2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；3)将步骤1)的ALP100-200μL置于乙酸盐(pH＝5.20.01-0.05M)缓冲液中，2-8℃中透析2-4h；4)取出透析过的ALP，向其中加入步骤2)中过碘酸钠NaIO4溶液2-4μL，于室温避光反应30-60min；5)向上述混合液中加入1-4μL甘油轻轻混匀，以除去过量的过碘酸钠；6)将步骤5)中的混合液置于乙酸盐(pH＝5.20.01-0.05M)缓冲液，透析4-8h，除去未反应的试剂；7)更换0.02-0.05MpH＝9.5的碳酸盐缓冲液，2-8℃反应4-8h；并加入鼠抗人IgA单克隆抗体，使其浓度达到2-4mg/ml；8)加入NaBH4使其终浓度为5-10mM，2-8℃孵育6-18h；9)完成的标记液用0.01-0.05MPBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。优选的，辣根过氧化酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体的制备方法，1)配制5-10mg/mLHRP溶液；2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；3)将步骤1)的HRP100-200μL置于乙酸盐(pH＝5.20.01-0.05M)缓冲液中，2-8℃中透析2-4h；4)取出透析过的HRP，向其中加入步骤2)中过碘酸钠NaIO4溶液2-4μL，于室温避光反应30-60min；5)向上述混合液中加入1-4μL甘油轻轻混匀，以除去过量的过碘酸钠；6)将步骤5)中的混合液置于乙酸盐(pH＝5.20.01-0.05M)缓冲液，透析4-8h，除去未反应的试剂；7)更换0.02-0.05MpH＝9.5的碳酸盐缓冲液，2-8℃反应4-8h；并加入鼠抗人IgA单克隆抗体，使其浓度达到2-4mg/ml；8)加入NaBH4使其终浓度为5-10mM，2-8℃孵育6-18h；9)完成的标记液用0.01-0.05MPBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。优选的，步骤1)中，碱性磷酸酶或辣根过氧化酶的活化可以用以下步骤替换，碱性磷酸酶活化步骤：a)配制5-20mg/mLALP溶液。b)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液。c)将步骤1)和步骤2)配制溶液按质量比为1：(0.5-1)的比例充分混合，2-8℃避光反应30-60min；d)配置浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤c)配制的溶液以相同体积混合，常温避光反应0.5-2h，活化即完成。辣根过氧化酶活化步骤：a)配制5-10mg/mLHRP溶液。b)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液。c)将步骤1)和步骤2)配制溶液按质量比为1：(0.5-1)的比例充分混合，2-8℃避光反应30-60min；d)配置浓度为10-40μL/mL的乙二醇水溶液，与步骤c)配制的溶液以相同体积混合，常温避光反应0.5-2h，活化即完成。优选的，FITC标记新型冠状病毒抗原制备包括以下步骤，1)将待标记重组抗原置于透析袋中，透析缓冲液为0.02-0.05M碳酸盐缓冲液，透析1-4h；2)将FITC溶于二甲基亚砜中，配置浓度为1mg/mL；FITC每次使用均需新鲜配置，并要求避光。3)将透析完成的重组抗原与FITC按照质量比为1:(0.5-1)的比例进行混合，轻摇混匀，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：包括抗FITC抗体包被板、FITC标记新型冠状病毒抗原、碱性磷酸酶或辣根过氧化酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：包括抗FITC抗体包被板、FITC标记新型冠状病毒抗原、碱性磷酸酶或辣根过氧化酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体。


2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：FITC标记新型冠状病毒抗原中的新型冠状病毒抗原为S-RBD蛋白。


3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：还包括稀释液，稀释液包括如下组分Tris5-10g/L；NaCl10-20g/L；BSA6-20g/L；海藻糖5-20g/L；Tween-200.5-5mL/L；ProClinTM3000.5-2mL/L；硫酸庆大霉素1-5mL/L，且pH为8.0±0.2。


4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：FITC标记新型冠状病毒抗原、辣根过氧化酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体的工作浓度分别为0.5～5μg/mL。


5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测试剂盒，其特征在于：
碱性磷酸酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体的制备方法，
1)配制5-20mg/mLALP溶液；
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将步骤1)的ALP100-200μL置于乙酸盐(pH＝5.20.01-0.05M)缓冲液中，2-8℃中透析2-4h；
4)取出透析过的ALP，向其中加入步骤2)中过碘酸钠NaIO4溶液2-4μL，于室温避光反应30-60min；
5)向上述混合液中加入1-4μL甘油轻轻混匀，以除去过量的过碘酸钠；
6)将步骤5)中的混合液置于乙酸盐(pH＝5.20.01-0.05M)缓冲液，透析4-8h，除去未反应的试剂；
7)更换0.02-0.05MpH＝9.5的碳酸盐缓冲液，2-8℃反应4-8h；并加入鼠抗人IgA单克隆抗体，使其浓度达到2-4mg/ml；
8)加入NaBH4使其终浓度为5-10mM，2-8℃孵育6-18h；
9)完成的标记液用0.01-0.05MPBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。
辣根过氧化酶标记鼠抗人IgA单克隆抗体的制备方法，
1)配制5-10mg/mLHRP溶液；
2)配制10-20mg/mL过碘酸钠NaIO4溶液；
3)将步骤1)的HRP100-200μL置于乙酸盐(pH＝5.20.01-0.05M)缓冲液中，2-8℃中透析2-4h；
4)取出透析过的HRP，向其中加入步骤2)中过碘酸钠NaIO4溶液2-4μL，于室温避光反应30-60min；
5)向上述混合液中加入1-4μL甘油轻轻混匀，以除去过量的过碘酸钠；
6)将步骤5)中的混合液置于乙酸盐(pH＝5.20.01-0.05M)缓冲液，透析4-8h，除去未反应的试剂；
7)更换0.02-0.05MpH＝9.5的碳酸盐缓冲液，2-8℃反应4-8h；并加入鼠抗人IgA单克隆抗体，使其浓度达到2-4mg/ml；
8)加入NaBH4使其终浓度为5-10mM，2-8℃孵育6-18h；
9)完成的标记液用0.01-0.05MPBS于2-8℃透析20-24h，加入等体积甘油，-20℃保存。


6.权利要求5所述的新型冠状病毒IgA抗体化学发光法检测...

【专利技术属性】
技术研发人员：张振斌，栾大伟，刘萍，王程飞，侯玉文，杨桂霞，
申请(专利权)人：博奥赛斯天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12