HA在替代人宫颈粘液检测精子穿透力中的应用制造技术

本发明专利技术公开了HA在替代人宫颈粘液检测精子穿透力中的应用，无需宫颈粘液，利用浓度为0.1‑50mg/mL的HA即可替代人宫颈粘液用于检测精子穿透力，操作方便。

【技术实现步骤摘要】
HA在替代人宫颈粘液检测精子穿透力中的应用
本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及HA在替代人宫颈粘液检测精子穿透力中的应用。
技术介绍
防御素DEFB126是防御素家族成员之一，主要在人和猴等高等哺乳动物附睾中表达，啮齿类动物中则不存在。已有的文献研究发现，不同于其它防御素家族成员，DEFB126是一种高度糖基化修饰的短肽，其C-末端有多个O-链接的寡糖修饰位点，在精子穿过附睾的过程中，附睾液中的寡糖会吸附在其表面，使精子表面富含负电荷，预测当精子进入女性生殖道时，有利于其穿过同样富含负电荷的宫颈粘液，精子缺失DEFB126蛋白的表达，精子穿透宫颈粘液的能力将降低。已有文献以及我们的前期研究结果发现，DEFB126基因编码区，有2个移码突变位点，rs11467417和rs11467497位点。rs11467417移码突变是一个高频突变，在男性中的突变率高达20％左右，发生该移码突变的男性，其精子中的DEFB126蛋白的表达很不稳定，我们通过蛋白印迹试验检测了不同基因型精子DEFB126蛋白的表达，并通过凝集素芯片试验——一种检测精子表面糖基化修饰水平的高通量检测方法，发现有8种凝集素，与DEFB126的基因突变相关，说明DEFB126发生了rs11467417位点突变，会改变精子表面的糖基化修饰水平。rs11467497移码突变(4dd)是一种低频突变，在不育男性中的发生率仅为0.1％，但该突变会导致DEFB126蛋白完全不表达，是DEFB126蛋白表达天然缺陷型。精子穿越宫颈粘液的能力与带有负电荷的唾液酸终末残基有关，因为去除DEFB126蛋白中的这些残基会导致能够穿越宫颈粘液的精子数量减少。多项研究表明，中国约有19％的男性，DEFB126基因编码区发生双核苷酸缺失导致移码突变，分子研究机制发现，rs11467417纯合子突变(2dd)的男性附睾中产生的DEFB126mRNA表达量降低，精子穿越宫颈粘液的能力也降低，推测发生DEFB126纯合突变的精子表面糖结构发生了改变，DEFB126基因del/del突变中精子表面聚糖的变化可能与受精能力有关。男性不孕症通常通过精液质量分析来评估，如通过射精时精子数量、活动精子百分比和形态正常精子百分比来评价。对于DEFB126rs11467417纯合突变(2dd)的精子，其精液常规指标正常，但纯合子突变的精子穿过宫颈粘液的能力明显降低。另外，通过DEFB126基因型分析与生殖成功率的群体研究发现，携带DEFB1262dd基因型的男性，仅有60％夫妇2年内成功受孕，并且比携带有wt/wt(2ww)或wt/del(2wd)两种基因型的男性怀孕时间平均多2个月。研究精子穿透宫颈粘液的能力，需要收集宫颈粘液；但人宫颈粘液很难获得，且具有高变异性。因此，提供一种人宫颈粘液的替代溶液是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了HA在替代人宫颈粘液检测精子穿透力中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：透明质酸HA在替代宫颈粘液检测精子穿透力中的应用。进一步，所述HA的浓度为0.1-50mg/mL。进一步，精子穿透宫颈粘液的能力在判断男性不育中的应用。进一步，精子穿透HA的能力在判断男性不育中的应用。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了HA在替代人宫颈粘液检测精子穿透力中的应用，无需宫颈粘液，利用浓度为0.1-50mg/mL的HA即可替代人宫颈粘液用于检测精子穿透力，操作方便。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术人宫颈粘液与0.1～5mg/mLHA的粘度数据；图2附图为本专利技术HA玻片结构；图3附图为本专利技术Nikon相差显微镜进行视频拍摄捕捉显微镜视野的中心区域；图4附图为本专利技术DEFB126rs11467417野生型的序列分析；图5附图为本专利技术DEFB126rs11467417杂合型的序列分析；图6附图为本专利技术DEFB126rs11467417del/del纯合型等位基因的序列分析；图7附图为本专利技术DEFB126rs11467417供体精子穿越HA个数；其中，rs11467417位点基因型(2ww野生型、2wd杂合子、2dd纯合子)；图8附图为本专利技术DEFB126rs11467497供体精子穿越HA个数；其中，rs11467497位点基因型(4ww野生型、4wd杂合子、4dd纯合子)图9附图为本专利技术DEFB126rs11467417供体精子活动率；图10附图为本专利技术DEFB126rs11467497供体精子活动率。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1(1)研究对象随机选取2019.10-2020.01月在上海集爱遗传与不育诊疗中心接受不孕不育治疗的男性，且排除精液常规检查不正常的精液样本，即纳入标准为精子数量>15×106万/ml，前向运动精子(PR)>32％且无生殖道感染。(2)DEFB126基因型的鉴定根据DEFB126基因组序列，使用引物(正向引物：5’-TGTCTAAACGACGTTGGAATTT-3’，SEQIDNO.1；反向引物：5’-CCCTAGCATCACCTGGGAACT-3’，SEQIDNO.2)对缺失片段进行扩增，PCR扩增的总体系为50uL，包含引物、10ng基因组DNA、200μMdNTPs、1.5mMMg2+和1UTaq聚合酶。PCR循环条件为：95℃预变性10min；95℃变性10s，57℃退火15s，72℃延伸45s，45个循环；72℃延伸10min。扩增产物的测序引物为5’-AATTGGAAACTAAAAGTGAGCC-3’，SEQIDNO.3。(3)精子准备和精液常规分析用含3％BSA的BWW溶液上游精子30min后取上层精子，300g离心后重悬于BWW溶液，离心并重复洗涤两次，重悬后调整精子终浓度为30×106/ml左右并采用计算机辅助精子分析方法测定精子活力，37℃保温待用。(4)精子穿越透明质酸溶液的能力通过黏度比较分析，确定0.1-50mg/mLHA能够很好地模拟人宫颈粘液的粘度，结果见图1。图1横坐标为剪切速率，纵坐标为粘度，随剪切速率变大，0.1-50mg/mLHA和3个样本(sample1、sample2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.HA在替代人宫颈粘液检测精子穿透力中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.HA在替代人宫颈粘液检测精子穿透力中的应用。


2.根据权利要求1所述的HA在替代人宫颈粘液检测精子穿透力中的应用，其特征在于，所述HA的浓度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：施惠娟，茹彦飞，王雪梅，顾一骅，袁瑶，刘淼，施长根，
申请(专利权)人：上海市计划生育科学研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31