通过IGFBP5介导动脉粥样化的动物模型及建立方法技术

本发明专利技术公开了通过IGFBP5介导的动脉粥样硬化动物模型及建立方法，所述动物模型按照以下步骤进行：步骤1、构建腺相关病毒表达载体AAV‑IGFBP5；步骤2、将步骤1得到的所述腺相关病毒载体通过肌肉注射到ApoE

【技术实现步骤摘要】
通过IGFBP5介导动脉粥样化的动物模型及建立方法
本专利技术属于基础医学
，具体涉及一种通过IGFBP5介导动脉粥样化的动物模型，还涉及上述动脉粥样化动物模型的建立方法。
技术介绍
动脉粥样硬化是多种心血管疾病的主要原因，脂质代谢障碍为动脉粥样硬化的病变基础，其病变从血管内膜开始，一般先有脂质和复合糖类积聚、出血及血栓生成，进而纤维组织增生及钙质沉着，累及动脉中层的逐渐蜕变和钙化，导致动脉壁增厚变硬，存在于动脉内膜积聚的脂质成黄色粥样，称动脉粥样硬化。胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBPs)是胰岛素的成员总科的蛋白质。在哺乳动物中，已经鉴定出6种典型的IGFBPs，IGFBP5是IGFBPs家族中最保守的蛋白，它已经被证明可以调节细胞生长、分化、迁移、侵袭和细胞代谢、影响糖尿病和胰岛素耐受性等。在对动脉粥样硬化进行实验研究时，需要制备实验动物模型。现有的技术中，中小型动物在实验模型的构建中，一般都会使用高脂饲养以及球囊损伤的方法，需要12周去干预实验动物，耗费的时间与人力都十分庞大。
技术实现思路
本专利技术第一个目的是提供一种通过IGFBP5介导动脉粥样硬化的动物模型，缩短了动物模型的构建时间，且表达更加稳定，安全系数高。本专利技术第二个目的是提供上述IGFBP5动物模型的构建方法。本专利技术所采用的第一种技术方案是：通过IGFBP5介导的动脉粥样硬化动物模型，动物模型通过外源注射腺相关病毒系统性高表达IGFBP5得到。本专利技术所采用的第二种技术方案是：通过IGFBP5介导的动脉粥样硬化动物模型的建立方法，按照以下步骤进行：步骤1、构建腺相关病毒表达载体AAV-IGFBP5；步骤2、将步骤1得到的腺相关病毒载体AAV-IGFBP5通过肌肉注射到ApoE-/-小鼠中，注射后采用高脂饲料喂养6周，6周后得到的小鼠即得到本专利技术的动物模型。本专利技术所采用的第二种技术方案的特点还在于，步骤1中腺相关病毒表达载体AAV-IGFBP5具体构建步骤如下：步骤1.1、采用根据已知目的基因IGFBP5cDNA序列设计合成扩增引物，上游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示，用PCR法扩增目的基因IGFBP5，扩增条件：98℃，3min；98℃，10s；55℃，15s；72℃，1min，35个循环；72℃，10min；4℃，5min，扩增完毕用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物；步骤1.2、将步骤1.1所得的目的基因PCR产物用BamHI、Xhol内切酶双酶切，同时用这两种酶内切酶切割rAAV载体，将切割后的目的基因与rAAV载体混合，用T4DNA连接酶在4℃的条件下连接12h，将连接得到的产物转化到E.coliDH5α感受态细胞中，经Kan+LB培养基培养后采用碱裂解法提取重组质粒，对得到的重组质粒进行阳性克隆鉴定；步骤1.3、采用骤1.2鉴定正确的质粒转化E.coliDH5α感受态细胞，挑取单克隆、摇菌和质粒提取，所提取的质粒转染到HEK293细胞，培养72h后将细胞离心收集，在4℃的条件下，于53000r/min高速离心30h，收集富含rAAV的细胞上清液；步骤1.4、将步骤1.3中得到的细胞上清液加入树脂柱进行柱纯化，收集最终得到的纯化后的病毒，于-80℃保存。步骤1.3中转染前1天将HEK293细胞于直径为100mm的培养皿，转染时细胞密度75％-85％。步骤2中高脂饲料的胆固醇和脂肪量均为1.5％cholesterol+15％fat。步骤2中注射入ApoE-/-小鼠的腺相关病毒表达载体AAV-IGFBP5的浓度是1×1011vp/mL。本专利技术的有益效果是：与现有动物模型的建立方法相比，12周的实验动物模型构建时间太长并且消耗人力物力都十分巨大，本专利技术所提到的动物模型构建方法所需时间只有6周就可以构建所需的动脉粥样硬化模型。与一般的注射外源性蛋白方法相比，腺相关病毒的转染效率高，携带目的基因表达时间长，因此不需要频繁的注射蛋白，只需要注射一次即可。并且该载体扩散性更好，免疫原性低，安全系数高，在体内表达更稳定。附图说明图1为本专利技术动物模型与对照组通过油红O染色后显微镜拍照主动脉弓斑块时的对比示意图；图2为本专利技术通过计算各组斑块面积后所得到的统计对比图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行详细说明。本专利技术通过IGFBP5介导动脉粥样硬化的动物模型，所述动物模型可通过外源注射腺相关病毒系统性高表达IGFBP5得到，本专利技术制备的动物模型的造模时间相比于现有的造模时间明显缩短，操作简单，只需注射一次药物，并且表达更加安全稳定。本专利技术通过IGFBP5介导动脉粥样化的动物模型的构建方法，具体包括以下步骤：步骤1、构建腺相关病毒表达载体AAV-IGFBP5步骤1.1、采用根据已知目的基因IGFBP5cDNA序列设计合成上、下游引物:上游引物Forwardprimer:CATCTGAATCCTCCTTGCC下游引物Reverseprimer:GTGTCTCCTTAGCCCTTGC用PCR法扩增目的基因IGFBP5，扩增条件为：98℃，3min；98℃，10s；55℃，15s；72℃，1min。35个循环；72℃，10min；4℃，5min。扩增完毕用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物。步骤1.2、将步骤1.1所得的目的基因IGFBP5用BamHI、Xhol内切酶双酶切，同时用这两种酶内切酶切割腺相关病毒载体rAAV，将切割后的目的基因片段与rAAV载体混合，混合后用T4DNA连接酶于4℃条件下连接12h，将连接得到的产物转化到E.coliDH5α感受态细胞中，经Kan+LB培养基培养后采用碱裂解法提取重组质粒，对得到的重组质粒进行阳性克隆鉴定。步骤1.3、采用骤1.2鉴定正确的重组质粒转化E.coliDH5α感受态细胞，挑取单克隆、摇菌，进行大规模质粒提取，转染前一天，将HEK293细胞于直径为100mm的培养皿培养，所提取的质粒转染到HEK293细胞中，培养72h后将细胞离心收集，于4℃的条件下53000r/min高速离心30h，收集富含rAAV的细胞上清液。步骤1.4、将步骤1.3中得到的细胞上清液加入树脂柱进行柱纯化，收集最终得到的纯化后的病毒表达载体AAV-IGFBP5，于-80℃保存，并对病毒标准稀释品进行滴度测定。步骤2、ApoE-/-小鼠肌肉注射步骤1.4的腺相关病毒表达载体AAV-IGFBP5后，将ApoE-/-小鼠采用高脂饲料喂养6周，得到的小鼠即为本专利技术的动物模型。高脂饲料的胆固醇和脂肪量均为1.5％cholesterol+15％fat。上述ApoE-/-小鼠肌肉注射时腺相关病毒表达载体AAV-IGFBP5的浓度是1×1011vp/mL。模型验证：1.实验对象(1)选用本专利技术制备好的动物模型为试验组(A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.通过IGFBP5介导的动脉粥样硬化动物模型，其特征在于，所述动物模型通过外源注射腺相关病毒系统性高表达IGFBP5得到。/n

【技术特征摘要】
1.通过IGFBP5介导的动脉粥样硬化动物模型，其特征在于，所述动物模型通过外源注射腺相关病毒系统性高表达IGFBP5得到。


2.一种权利要求1所述的通过IGFBP5介导的动脉粥样硬化动物模型的建立方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
步骤1、构建腺相关病毒表达载体AAV-IGFBP5；
步骤2、将步骤1得到的所述腺相关病毒载体AAV-IGFBP5通过肌肉注射到ApoE-/-小鼠中，注射后采用高脂饲料喂养6周，6周后得到的小鼠即得到本发明的动物模型。


3.根据权利要求2所述的通过IGFBP5介导的动脉粥样硬化动物模型的建立方法，其特征在于，所述步骤1中腺相关病毒表达载体AAV-IGFBP5具体构建步骤如下：
步骤1.1、采用根据已知目的基因IGFBP5cDNA序列设计合成扩增引物，上游引物如SEQIDNO:1所示，下游引物如SEQIDNO:2所示，用PCR法扩增目的基因IGFBP5，扩增条件：98℃，3min；98℃，10s；55℃，15s；72℃，1min，35个循环；72℃，10min；4℃，5min，扩增完毕用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PCR产物；
步骤1.2、将步骤1.1所得的目的基因PCR产物用BamHI、Xhol内切酶双酶切，同时用这两种酶内切酶切割rAAV载体，将切割后的目的基因与rAAV载体混合，...

【专利技术属性】
技术研发人员：相奥琪，梁国朵，余琦，张云婷，
申请(专利权)人：西安医学院，
类型：发明
国别省市：陕西;61