ND4基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种包含ND4基因表达盒的重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体的骨架为pAAV5，所述ND4基因表达盒包含人ND4基因或优化的人ND4基因。本发明专利技术还公开了该重组腺相关病毒载体的制备方法和应用。本发明专利技术将pAAV5作为ND4的基因载体，将ND4转导至病人眼中时，在确保安全性的同时，在视网膜上的表达量更高，具有更高的转导效率和高效的表达能力，感染视神经细胞的能力更强。将其制备为玻璃体腔注射的药物，能够增强该基因在Leber’s基因治疗中效果，并且可以减少注射剂量和缩短治愈时间。

【技术实现步骤摘要】
ND4基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物制药领域，尤其涉及一种ND4基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和应用。
技术介绍
Leber遗传性视神经病变(Leber’shereditaryopticneuropathy，LHON)是一种主要累及黄斑乳头束纤维，导致视神经退行性变的线粒体遗传性疾病。本病好发于青中年男性，临床表现为双眼同时或先后急性或亚急性无痛性视力减退，同时可伴有中心视野缺损及色觉障碍。LHON由线粒体位点突变引起，我国学者已初步确认中国95﹪以上的LHON患者分别与线粒体DNA中11778、14484和3460的位点突变有关，其中11778位点突变最常见，占我国LHON的89.2％，且预后最差。线粒体DNA的11778位点突变的发病机制是，线粒体DNA(mtDNA)第11778位的核苷酸发生突变引起的，即鸟嘌呤(G)→腺嘌呤(A)，此突变使呼吸链上NADH脱氢酶亚单位4(ND4)中基因编码的第340位氨基酸由精氨酸变为组氨酸。虽然它们均为碱性氨基酸，但这一位置的精氨酸是高度保守的。由于突变可能降低电子流动效率影响酶的活性从而减少视神经细胞ATP的产生，细胞逐渐凋亡，从而导致患者发生LHON。LHON目前尚无方法治疗，是世界公认的青少年致盲眼病之一，随着基因治疗的发展，LHON的基因治疗成为可能，其中的难点在于转染的基因进入细胞核，而LHON的突变位点在线粒体DNA，是线粒体中的ND4异常所致。国内外已有公司或机构利用这一技术，利用腺相关病毒(adenovirusassociatedvirus)AAV2包装该核酸序列(参见CN102634527B)为基因药物，用于实验研究和临床试验，已取得初步成效。但是利用AAV2的转导效率低，严重依赖HSP，而且表达缓慢，并会被可溶性肝素所抑制，而且只能到达视网膜浅层。因此急需一种转导效率更高、表达迅速的ND4重组表达载体。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服现有技术中AAV2包装NADH脱氢酶亚单位4(ND4)序列为基因药物时转导效率低、表达缓慢等缺陷，提供一种ND4基因重组腺相关病毒载体及其制备方法和应用。本专利技术将rAAV5作为ND4的基因载体，将ND4转导至病人眼中时，在确保安全性的同时，在视网膜上的表达量更高，具有更高的转导效率和高效的表达能力，感染视神经细胞的能力更强。将其制备为玻璃体腔注射的药物，能够增强该基因在Leber’s基因治疗中效果，并且可以减少注射剂量和缩短治愈时间。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种包含ND4基因表达盒的重组腺相关病毒载体，所述重组腺相关病毒载体的骨架为pAAV5(即，5型重组腺相关病毒载体)，所述ND4基因表达盒包含人ND4基因或优化的人ND4基因。较佳地，所述ND4基因表达盒从N端至C端依次包含启动子、线粒体靶向序列、人ND4基因或优化的人ND4基因、和/或UTR序列。较佳地，所述启动子为CMV启动子或CAG启动子；所述启动子的核苷酸序列优选如SEQIDNO:3或SEQIDNO:7所示。本专利技术可以选取表达强度高于CMV的强启动子CAG，选取强启动子和最优人种序列重组构建腺相关病毒，进行包装的基因药物将可以减少注射剂量和缩短治愈时间。较佳地，所述线粒体靶向序列的核苷酸序列如SEQIDNO:4、SEQIDNO:9或SEQIDNO:10所示；和/或，所述UTR序列的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。较佳地，所述人ND4基因的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，所述优化的人ND4基因的核苷酸序列如SEQIDNO:8或SEQIDNO:11所示。较佳地，所述ND4基因表达盒的核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示。或者所述ND4基因表达盒的核苷酸序列从N端至C端依次为SEQIDNO:7、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:7、SEQIDNO:4、SEQIDNO:8、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:11、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:7、SEQIDNO:4、SEQIDNO:11、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:8、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:8、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:3、SEQIDNO:10、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:3、SEQIDNO:10、SEQIDNO:8、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:7、SEQIDNO:10、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:7、SEQIDNO:10、SEQIDNO:8、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:3、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:7、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:6。在本专利技术某一较佳实施例中，所述ND4基因表达盒的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，具体包括CMV启动子(203bp)，融合蛋白起始在MTS序列(84bp)，起始密码子为ATG，编码28个氨基酸，NADH脱氢酶亚单位4基因序列(1380bp)编码460个氨基酸，UTR序列为COX10-Fμll(1425bp)。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种转化体，将上述的重组腺相关病毒载体导入宿主，并使之整合在所述宿主的基因组上。较佳地，所述宿主为哺乳动物细胞；更佳地，所述哺乳动物细胞为HEK293细胞。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种制备上述的重组腺相关病毒载体的方法，其包含以下步骤：将所述ND4基因表达盒插入到腺相关病毒载体pAAV5中即得。该方法能快速，简便地构建携带不同重组人NADH脱氢酶亚单位4基因的重组腺相关病毒载体，并包装获得复杂缺陷腺相关病毒载体。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种制备ND4融合蛋白的方法，其包括以下步骤：(1)制备上述的转化体；(2)筛选重组子，获得阳性克隆，表达并纯化ND4融合蛋白。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了上述的重组腺相关病毒载体在制备治疗Leber遗传性视神经病变的药物中的应用。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本专利技术各较佳实例。本专利技术所用试剂和原料均市售可得。本专利技术的积极进步效果在于：本专利技术将rAAV5作为ND4的基因载体，将ND4转导至病人眼中时，在确保安全性的同时，在视网膜上的表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含ND4基因表达盒的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体的骨架为pAAV5，所述ND4基因表达盒包含人ND4基因或优化的人ND4基因。/n

【技术特征摘要】
1.一种包含ND4基因表达盒的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体的骨架为pAAV5，所述ND4基因表达盒包含人ND4基因或优化的人ND4基因。


2.如权利要求1所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述ND4基因表达盒从N端至C端依次包含启动子、线粒体靶向序列、人ND4基因或优化的人ND4基因、和/或UTR序列。


3.如权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述启动子为CMV启动子或CAG启动子；所述启动子的核苷酸序列优选如SEQIDNO:3或SEQIDNO:7所示。


4.如权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述线粒体靶向序列的核苷酸序列如SEQIDNO:4、SEQIDNO:9或SEQIDNO:10所示；和/或，所述UTR序列的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。


5.如权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述人ND4基因的核苷酸序列如SEQIDNO:5所示，所述优化的人ND4基因的核苷酸序列如SEQIDNO:8或SEQIDNO:11所示。


6.如权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述ND4基因表达盒的核苷酸序列如SEQIDNO:1或SEQIDNO:2所示；或者所述ND4基因表达盒的核苷酸序列从N端至C端依次为SEQIDNO:7、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:7、SEQIDNO:4、SEQIDNO:8、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:11、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:7、SEQIDNO:4、SEQIDNO:11、SEQIDNO:6，或SEQIDNO:3、SEQIDNO:9、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6，或SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，
申请(专利权)人：武汉纽福斯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42