一种定量评价移植至斑马鱼胚胎内的肿瘤细胞增殖的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种定量评价移植至斑马鱼胚胎内的肿瘤细胞增殖的方法，其特征在于注射前将肿瘤细胞进行荧光标记、注射后1天选择携带荧光肿瘤细胞的斑马鱼胚胎进一步培养、以及在注射后3至7天通过定量PCR法扩增人肿瘤细胞基因评价人肿瘤细胞在斑马鱼胚胎内定殖与增殖情况。经过预先荧光标记的肿瘤细胞注射时期为受精后48小时，注射部位为卵周隙区。每胚胎的注射体积为10nL，注射肿瘤细胞数为300～500个。定量评估时，一般任选数个胚胎为一组，通过定量PCR检测人基因的含量。注射后3至7天是评价人肿瘤细胞是否在胚胎内增殖的有效时间窗口。本发明专利技术有益于将斑马鱼的PDX(病人来源的细胞移植)模型实用化。

【技术实现步骤摘要】
一种定量评价移植至斑马鱼胚胎内的肿瘤细胞增殖的方法
本专利技术属于生物
，涉及一种定量评价移植至斑马鱼胚胎内的肿瘤细胞增殖的方法，其特征在于注射前将肿瘤细胞进行荧光标记、注射后1天选择携带荧光肿瘤细胞的斑马鱼胚胎进一步培养、以及在注射后3至7天(相当于受精后5至9天胚胎)这一窗口期通过定量PCR法扩增人肿瘤细胞基因评价人肿瘤细胞在斑马鱼胚胎内定殖与增殖情况。技术背景一般认为，肿瘤的发生是源于多基因突变的累积作用。由于肿瘤病人基因突变的多样性，已有的肿瘤靶向药物常常只能针对携带某类特定基因突变的癌症病人才能发挥疗效。因此，针对不同肿瘤病人，及时从已有肿瘤药物库中寻找到有针对性的临床药物，建立癌症病人的个性化治疗方案，有利于实现肿瘤的精准医疗。病人被确诊为恶性肿瘤后，将分离自病人的癌细胞移植至小鼠或斑马鱼等模式动物早期发育的胚胎中后，这些癌细胞有可能在模式动物早期胚胎中继续恶性增殖。这种将取自病人的肿瘤细胞异体移植至动物胚胎中建立的模型被称为PDX(patientderivedxenograft)模型。如果将肿瘤药物处理以这种方法建立起来的PDX模型，可以区分出哪种靶向药物可有效杀死或抑制病人的癌细胞，以此可建立癌症病人个性化治疗的方案。如何评价靶向肿瘤药物是否可有效抑制肿瘤细胞增殖是利用PDX模型建立癌症病人个性化治疗方案的关键。最直观的评价办法是通过荧光标记肿瘤细胞，如果PDX模型胚胎在肿瘤细胞移植后的发育过程中，荧光亮度增强，则可以判断肿瘤细胞在恶性增生；在这种情况下，如果加入治疗肿瘤的靶向药物，荧光强度不再增加甚至消失，那么可以判断目标药物具备抑制或杀死肿瘤细胞的作用，因而可以适用于个性化治疗。荧光标记通过两种方法实现。其一就是利用病毒在肿瘤细胞中稳定地重组荧光报告基因。当报告基因稳定地重组入肿瘤细胞内时，那么随着肿瘤细胞的恶性增生，荧光报告基因也必然因为DNA的复制而得到倍比增加。然而，这一方法虽在技术研究中适用，但明显不能适用于临床运用。因为一旦病人被诊断为罹患恶性肿瘤后，必须及时选择合适的治疗方案，因而临床上的给出的测试药物靶向有效性的窗口时间有限，这样的有限的窗口时间显然不足够用来支持在分离自病人的肿瘤细胞中稳定转导携带可表达荧光报告基因的病毒。标记肿瘤细胞的另外一个常用策略是直接用荧光染料染色肿瘤细胞。但这种方法也存在着明显的缺点，那就是荧光标记的染料不会随细胞的增殖而增加，再者未增殖的细胞碎片上的荧光染料依然存在。因此，利用此种标记方法，不能实现对肿瘤细胞增殖的直接观测。另外，异体细胞移植对动物胚胎细胞的损伤较大，在实践中相当多的胚胎因为细胞移植时的机械损伤而在胚胎后续发育过程中死亡，因而本身不能用作评价的对象。事实上，最确切反映细胞增殖的指标是病人细胞基因组DNA的复制。因而通过检测病人基因组DNA在PDX模型中的量的变化，能够评价肿瘤细胞是否在斑马鱼等模式动物胚胎中出现定殖与增殖。为解决如何评价肿瘤细胞移植至斑马鱼等模式动物胚胎中后是否定殖与增殖这一技术难题，我们专利技术了一种定量评价肿瘤细胞移植至斑马鱼胚胎内后增殖的方法。其特征在于将肿瘤细胞首先用荧光染料进行荧光标记，然后将标记的肿瘤细胞计数后按一定细胞数通过显微注射注入斑马鱼胚胎，待注射胚胎发育后，在荧光显微镜下选择发育相对正常且携带荧光标记的斑马鱼胚胎作为PDX模型胚胎，于不同发育时期逐次收集部分胚胎、快速制备基因组DNA模板、进行定量PCR扩增肿人瘤细胞基因，最后根据定量PCR结果评价异体移植肿瘤细胞在斑马鱼胚胎内是否有效增殖。作为个性化药物的筛选策略，另取一半PDX胚胎进行靶向肿瘤药物处理，通过采用与对未处理药物胚胎类似的评价方法，最后根据定量PCR结果评价候选的肿瘤药物是否可以靶向抑制或杀死肿瘤细胞在动物胚胎内的生长和/或增殖。参考文献HidalgoM，etal.(2014)Patient-derivedxenograftmodels：Anemergingplatformfortranslationalcancerresearch.CancerDiscov4：998-1013.RitaFiora，etal.(2017)Single-cellfunctionalandchemosensitiveprofilingofcombinatorialcolorectaltherapyinzebrafishxenografts.ProcNatlAcadSciUSA.114(39)：E8234-E8243.ZhaoC，etal.(2011)Anovelxenograftmodelinzebrafishforhigh-resolutioninvestigatingdynamicsofneovascularizationintumors.PLoSOne6：e21768.AmatrudaJF，etal.(2002)Zebrafishasacancermodelsystem.CancerCell1：229-231.WelkerAM，etal.(2016)Correction：Standardizedorthotopicxenograftsinzebrafishrevealgliomacell-line-specifccharacteristicsandtumorcellheterogeneity.DisModelMech.9(9)：1063-5.
技术实现思路
将源自病人的肿瘤细胞移植至动物胚胎内制造PDX模型，然后通过对在PDX模型中添加肿瘤靶向药物观测靶向药物能否抑制肿瘤细胞的恶性增殖，从而筛选能靶向抑制或杀死病人肿瘤细胞的靶向药物，实现癌症病人的精准医疗。这一想法很早就有报道并首先在小鼠上进行了尝试。但是由于小鼠的免疫系统很早就开始发挥作用，因此小鼠的PDX模型需要在敲除小鼠免疫基因的基础上才能创制。斑马鱼由于对异源细胞的免疫性在胚胎发育早期尚未建立，因而，很多的研究集中在使用斑马鱼胚胎建立PDX模型。虽然已有很多报道证明多种肿瘤细胞可以在斑马鱼胚胎内成功定植并成功增殖，但是由于其技术难度大、重复性差，如何快速准确定量评价肿瘤细胞是否能在斑马鱼胚胎中定殖与增殖一直没有成功的技术方法。本专利技术公布了一种定量评价移植至斑马鱼胚胎内的肿瘤细胞增殖的方法，其特征在于注射前将肿瘤细胞进行荧光标记、注射后1天选择携带荧光肿瘤细胞的斑马鱼胚胎进一步培养、以及在注射后3至7天(相当于受精后5至9天胚胎)这一窗口期通过定量PCR法扩增人肿瘤细胞基因评价人肿瘤细胞在斑马鱼胚胎内定殖与增殖情况。PDX模型成功建立的最基本前提是细胞移植的肿瘤细胞能够成功定殖于斑马鱼胚胎内。为实现这一目标，我们将肿瘤细胞进行了荧光标记。将标记的荧光细胞显微注射至斑马鱼胚胎后，待注射胚胎发育24小时后，在荧光解破镜下对注射胚胎进行筛选，只选择那些胚胎发育相对正常且具荧光的注射胚胎进行继续培养以用作下一步的分析。该步筛选是后续定量评价PDX模型中肿瘤细胞是否增殖的关键。没有这步筛选，可能造本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种定量评价移植至斑马鱼胚胎内的肿瘤细胞增殖的方法，其特征在于注射前将肿瘤细胞进行荧光标记、注射后1天选择携带荧光肿瘤细胞的斑马鱼胚胎进一步培养、以及在注射后3至7天(相当于受精后5至9天胚胎)这一窗口期通过定量PCR法扩增人肿瘤细胞基因评价人肿瘤细胞在斑马鱼胚胎内定殖与增殖情况。/n

【技术特征摘要】
1.一种定量评价移植至斑马鱼胚胎内的肿瘤细胞增殖的方法，其特征在于注射前将肿瘤细胞进行荧光标记、注射后1天选择携带荧光肿瘤细胞的斑马鱼胚胎进一步培养、以及在注射后3至7天(相当于受精后5至9天胚胎)这一窗口期通过定量PCR法扩增人肿瘤细胞基因评价人肿瘤细胞在斑马鱼胚胎内定殖与增殖情况。


2.如权利要求1所述的特征，标记肿瘤细胞的荧光物质是可以标记活细胞的任何荧光物质。而经荧光标记的肿瘤细胞其密度稀释为3～5×104/μL用于斑马鱼胚胎的显微注射。


3.如权利要求1所述的特征，用于注射的斑马鱼胚胎的发育时期为48hpf(受精后48小时)，注射部位为卵周隙(PVS)区。每胚胎的注射体积为10nL，注射的肿瘤细胞数量为300～500个每胚胎。


4.如权利要求1所述的特征，注射后24h(或1天，即1dp...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：南京尧顺禹生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32