本发明专利技术公开了MODIP基因在调控稻瘟菌生长发育与产孢中的应用。稻瘟菌MODIP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第127‑2547位所示，编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。稻瘟菌MODIP基因可用于调控稻瘟菌菌丝生长、分生孢子的产生以及对水稻的致病性。实验证明，稻瘟菌MODIP基因被潮霉素磷酸转移酶基因(hph)和荧光蛋白基因(SGFP)置换后，所得到的稻瘟菌敲除突变体的菌丝生长速度和产孢量明显低于于野生型稻瘟菌；致病性实验表明，稻瘟菌敲除突变体在水稻叶片上不能形成明显病斑；MODIP基因的缺失可导致稻瘟菌对水稻侵染能力的下降。本发明专利技术所提供的MODIP基因及其应用在稻瘟病的防控方面具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
MODIP基因在调控稻瘟菌生长发育与产孢中的应用本专利技术专利申请是专利申请号：201811117896.6，专利技术名称为：一种稻瘟菌MODIP基因及其应用的分案申请，其申请日为：2018年09月21日。
本专利技术属于生物基因工程
，具体涉及一种稻瘟菌MODIP基因及其应用。
技术介绍
由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻生产上最重要的病害之一，在我国各稻区均有发生。稻瘟病常年均有不同程度的发生，流行年份重病地区一般减产10-20％，重的达40-50％，甚至颗粒无收。稻瘟菌主要以菌丝体和分生孢子作为初侵染源，并以初侵染形成病斑上产生的分生孢子通过气流传播引起再侵染。稻瘟病菌成功侵染水稻主要包括多个连续的过程：分生孢子萌发、芽管伸长、附着胞形成、侵染钉分化和侵染性菌丝扩展等。其中，稻瘟菌的产孢量和分生孢子的萌发等与稻瘟病的发生密切相关。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种稻瘟菌MODIP基因及其应用。本专利技术的第一个目的是提供一种稻瘟菌MODIP基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1的第127-2547位所示。本专利技术的第二个目的是提供所述的稻瘟菌MODIP基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。本专利技术的第三个目的是提供一种稻瘟菌工程菌，其是将所述的稻瘟菌MODIP基因敲除后获得的工程菌。本专利技术的第四个目的是提供所述的稻瘟菌MODIP基因在降低稻瘟菌致病力中的应用。优选，所述的稻瘟菌MODIP基因在降低稻瘟菌对水稻的致病力中的应用。本专利技术的第五个目的是提供所述的稻瘟菌MODIP基因在调控稻瘟菌气生菌丝生长、分生孢子产生和/或分生孢子萌发中的应用。本专利技术通过克隆稻瘟菌野生型ZC13的MODIP基因，并制备敲除MODIP基因的稻瘟菌敲除突变体△MODIP，稻瘟菌MODIP基因被潮霉素磷酸转移酶基因(hph)和荧光蛋白基因(SGFP)置换。结果表明，将MODIP基因从稻瘟菌中成功敲除后，所获稻瘟菌敲除突变体△MODIP的气生菌丝生长减缓、分生孢子产生减少、分生孢子萌发减缓。进一步的实验证明，稻瘟菌敲除突变体△MODIP在水稻叶片上不能形成明显病斑，对水稻侵染能力下降，对水稻的致病力减弱。本专利技术所提供的MODIP基因及其应用在稻瘟病的防控方面具有重要意义。附图说明图1是稻瘟菌MODIP基因的敲除载体构建示意图。图2是部分稻瘟菌潮霉素阳性转化子MODIP基因的PCR检测，其中：泳道M：DNAmarker；泳道1：稻瘟菌野生型；泳道2-9：稻瘟菌的不同转化子。图3是部分稻瘟菌潮霉素阳性转化子A-hph基因的PCR检测，其中：泳道M：DNAmarker；泳道1：稻瘟菌野生型；泳道2-9：稻瘟菌敲除突变体的不同转化子。图4是稻瘟菌敲除突变体△MODIP(A)与野生型(B)的菌落形态。图5是稻瘟菌敲除突变体△MODIP与野生型的菌落直径比较，其中，MoZC13表示稻瘟菌野生型，MoZC13-△Dip表示稻瘟菌敲除突变体△MODIP。图6是稻瘟菌敲除突变体△MODIP与野生型的产孢量比较，其中，MoZC13表示稻瘟菌野生型，MoZC13-△Dip表示稻瘟菌敲除突变体△MODIP。图7是稻瘟菌敲除突变体△MODIP与稻瘟菌野生型的分生孢子萌发率比较，其中，MoZC13表示稻瘟菌野生型，MoZC13-△Dip表示稻瘟菌敲除突变体△MODIP。图8是稻瘟菌敲除突变体△MODIP分生孢子的GFP观察，其中：A，暗场；B，明场；，其中，MoZC13表示稻瘟菌野生型，MoZC13-△Dip表示稻瘟菌敲除突变体△MODIP。图9是稻瘟菌敲除突变体△MODIP对水稻的致病性测定，其中a：清水对照；b：稻瘟菌野生型；c：稻瘟菌敲除突变体△MODIP。具体实施方式以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例11、实验材料1.1供试菌株及植物稻瘟菌小种为广东省优势小种ZC13，供试水稻为籼稻品系CO39(不含已知抗稻瘟病基因)。1.2宿主菌及质粒载体克隆载体为pMD18-Tvector，基因敲除载体为双元载体pCT74。2、实验方法及结果2.1稻瘟菌MODIP基因的克隆根据MODIP基因的核苷酸序列，在起始密码子和终止密码子处分别设计该基因的上游和下游同源扩增引物Dip-F/Dip-R，序列如下：Dip-F：5’-GAGCAAAAGGTTGGACGATATAAGC-3’；Dip-R：5’-TCTACGGGTCTCACACAAGTAAATG-3’。采用CTAB法抽提稻瘟菌野生型(ZC13)的基因组DNA；取1μL的基因组DNA，用引物Dip-F/Dip-R进行PCR扩增。其反应体系为：PCR反应条件为：94℃反应5min；94℃反应1min，56℃反应1min，72℃反应1min，共35个循环；72℃反应10min。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，其片段大小约为2700bp，符合预期。将产物进行测序，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，共2731bp。经分析，MODIP基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1的第127-2547位所示，MODIP基因的蛋白质编码区的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。2.2MODIP基因的T载体连接及转化参考pMDTM18-TVectorCloningKit(TakaRa公司)试剂盒方法进行MODIP基因的载体连接。取1μLpMD18-T载体，加入4μL上述PCR产物和5μLsolutionI，于16℃连接过夜。取连接产物10μL加入到100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上放置30min；42℃水浴中热击90s，冰上冷却5min；加入800μLLB液体培养基，于37℃、150rpm振荡培养1.5h；于4000rpm离心5min，将沉淀涂布于LB培养基(含50μg/mLAmp)；于37℃培养16-24h；观察菌落生长状况，挑取白色菌落进行筛选。2.3稻瘟菌敲除载体的构建在MODIP基因的上游和下游各选取长度大小为1000bp左右的序列，并设计引物(表1)。表1稻瘟菌MODIP基因上游序列和下游序列同源片段的扩增引物以稻瘟菌基因组DNA为模板，分别用引物MODIP-upF和MODIP-upR、引物MODIP-downF和MODIP-downR扩增获得MODIP基因的上游同源片段(A片段)和下游同源片段(B片段)(图1)。用KpnI、ApaI分别酶切pCT74质粒和T载体上的MODIP上游同源臂，酶切产物回收后用T4连接酶连接；将pCT74-DIP上游同源臂和MODIP下游同源臂用EcoRI和SpeI双酶切，酶切产物回收后用T4连接酶连接；将其转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR和双酶切鉴定，结本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.稻瘟菌MODIP基因在调控稻瘟菌气生菌丝生长、分生孢子产生和/或分生孢子萌发中的应用，所述的稻瘟菌MODIP基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第127-2547位所示。/n
【技术特征摘要】
1.稻瘟菌MODIP基因在调控稻瘟菌气生菌丝生长、分生孢子产生和/或分生孢子萌发中的应用...
【专利技术属性】
技术研发人员：李云锋，冷梅钦，聂燕芳，王振中，李华平，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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