本发明专利技术公开了一株高产2‑苯乙醇酵母菌的筛选及其应用，属于发酵工程技术领域。通过筛选得到一株高产2‑苯乙醇酵母菌，本发明专利技术筛选得到的异常威克汉姆酵母1D6具有较高的L‑苯丙氨酸转化率，并且对反应体系中葡萄糖含量需求较低，葡萄糖浓度在20～40g/L就能达到较好的产量效果，并且对底物L‑苯丙氨酸的浓度要求低，仅需5～7g/L，在摇瓶发酵条件下，产量就能够达到2500mg/L以上。通过在发酵罐中扩大培养，产量可达到4727.29mg/L，具备良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一株高产2-苯乙醇酵母菌的筛选及其应用
本专利技术涉及一株高产2-苯乙醇酵母菌的筛选及其应用，属于发酵工程
技术介绍
2-苯乙醇(2-PE)是一种具有玫瑰香味的高级芳香醇，由于这个特点，使得2-苯乙醇成为香水、化妆品和食品工业中最常用的芳香化合物之一，作为最终产品的感官增强剂。然而2-PE还显示出其他有趣的特性，如它的抗真菌和抗菌性能，使这种化合物在消毒剂、害虫控制、清洁和个人护理产品中成为受欢迎的添加剂。此外2-PE可以很容易地酯化生成一种重要的风味物质，2-苯乙酸乙酯，它也有花香和玫瑰般的气味，用途与2-PE类似。目前，2-PE的生产方法主要有化学合成、植物提取。大多2-PE是由化学法合成而来，主要通过苯或苯乙烯的化学合成获得。然而化学合成法通常对环境不利，并且产生副产物，从而降低效率和下游成本。并且化学合成的2-PE在许多行业是禁止使用的，尤其是食品行业中。天然2-PE是消费者首选。它存在于许多花卉和植物精油中，如风信子、茉莉、玫瑰和百合，尤其是玫瑰。而从花卉中提取的天然2-PE价格昂贵，由于原材料稀缺，提取效率低、过程复杂，成本较高，无法满足市场需求。因此2-PE的生物合成受到广泛关注。细菌、丝状真菌和酵母等各种微生物都具有合成2-PE的能力。在已报道的2-PE生产菌中，有Saccharomycescerevisiae，Kluyveromycesmarxianus和Yarrowialipolytica是合成2-PE效率较高的菌。在酵母中，存在两条2-PE生物合成途径:莽草酸途径和埃利希途径。莽草酸盐途径是一种具有多分支和多种反馈抑制的长生物合成途径，以这种方式生产2-PE非常低，一般只能生产400-500mg/L。当L-苯丙氨酸作为唯一氮源时，2-PE可通过埃里希途径进行合成。ZhaoyueWang等(Regulationofcrucialenzymesandtranscriptionfactorson2-phenylethanolbiosynthesisviaEhrlichpathwayinSaccharomycescerevisiae.2017)通过对S.cerevisiae的埃里希途径中的关键酶和转录因子来调控2-PE生物合成，产量达3.73g/L。通过培养优化，使K.marxianus的2-PE产量从0.39提高到0.5g/L。YangGu等(RefactoringEhrlichPathwayforHigh-Yield2-PhenylethanolProductioninYarrowialipolytica.2020)在Y.lipolytica中通过阻断预处理竞争途径和减缓脂肪酸合成，2-PE产量为2669.54mg/L。JinbinLiu等(MimickingaNew2-PhenylethanolProductionPathwayfromProteusmirabilisJN458inEscherichiacoli.2018)从ProteusmirabilisJN458中获得一条产2-PE的新途径，通过在重组E.coliE-pAEAKaG中，以10g/L的L-苯丙氨酸为底物，经过16h的转化，获得3.21±0.10g/L的2-PE。虽然生物合成2-PE得到人们的重视，但2-PE对大多微生物有一定的毒性，由此限制了2-PE的产量。为了降低毒性，将原位产物回收(ISPR)应用于2-PE生产，并将2-PE的产量提高了。但利用有机相进行提取，被证明是不经济的。因此，发展2-PE生物技术生产的第一个具有挑战性的目标是鉴定高产菌株，筛选一株野生菌且高产2-PE将是一种更经济可行的方法。根据文献报道，2-苯乙醇在微生物中代谢途径主要有三种：莽草酸/苯丙酮酸途径、埃里希途径和苯乙胺途径。1、埃里希途径(Ehrlichpathway)在这三个途径中，最重要的是埃里希途径，在氮不足情况下，L-苯丙氨酸(L-苯丙氨酸)通过三个酶促步骤转化为2-PE。L-苯丙氨酸首先被转氨酶(ARO8，ARO9，BAT1/TWT1和BAT2/TWT2)氨基化为丙酮酸，然后被苯基丙酮酸脱羧酶(YDR380w/ARO10，YDL080C/THI3，PDC1，PDC5，和PDC6)，最后通过醇脱氢酶(ADH1，ADH2，ADH3，ADH4和ADH5)或甲醛脱氢酶(SFA1)还原为2-PE。2、莽草酸/苯丙酮酸途径(Shikimatepathway/Phenylpyruvatepathway)莽草酸/苯丙酮酸途径将碳水化合物代谢与芳香族化合物合成联系起来，包括三种芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)和其他芳香族次生代谢物，直接从葡萄糖生成2-PE。据文献报道，A.oryzae、K.marxianus和S.cerevisiae表现出从葡萄糖中生产2-PE的能力，但由于复杂的生物合成途径、多分支和多种反馈抑制，产量很低。在最佳生长条件下，芳香氨基酸的胞内浓度足以使对Phe和Tyr敏感的同工酶大量失活。因此，寻找具有增加L-苯丙氨酸或苯基丙酮酸盐的更健壮的菌株是提高莽草酸盐生产2-PE途径效率的关键。3、苯乙胺途径(Phenylethylaminepathway)苯乙胺途径与埃里希途径平行，在植物中起着更重要的作用，如西红柿。这条途径首先在酿酒酵母(S.cerevisiae)和米曲霉(A.oryzae)中发现。在这个过程中，L-苯丙氨酸首先脱羧为苯乙胺，然后氧化脱氨为苯乙醛，最后还原为2-PE。在矮牵牛和玫瑰花瓣中已发现了该途径的替代方法，其中的L-苯丙氨酸可以通过苯乙醛合酶(phenylacetaldehydesynthase，PAAS)一步转化为L-苯乙醛，然后进一步合成2-PE。在这三种途径中，大多利用埃里希途径，即以苯丙氨酸为底物进行全细胞转化生产2-苯乙醇。但是目前以苯丙氨酸为底物，利用全细胞转化法生产2-苯乙醇的产量还比较低，无法满足工业化生产的需求。因此获得一株对苯丙氨酸利用率且转化率都较高的野生菌株，对合成2-苯乙醇才具有重要作用。
技术实现思路
本专利技术提供了一种异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)1D6，已于2020年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2020333。本专利技术提供了一种微生物菌剂，所述菌剂中含有异常威克汉姆酵母1D6。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物菌剂中异常威克汉姆酵母的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物菌剂中异常威克汉姆酵母的含量不低于1.0×108cfu/mL或1.0×108cfu/g。在本专利技术的一种实施方式中，所述菌剂的制备方法为：取200～600μL的威克汉姆酵母1D6接种于10～30mLYPD液体培养基中，28℃下活化2至3代，待异常威克汉姆酵母1D6达到1.0×108cfu/mL以上活菌数时，5000～10000rpm下离心10～20min，去除上清液后，在无菌环境下依本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)，已于2020年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020333。/n
【技术特征摘要】
1.一种异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，已于2020年7月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2020333。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述异常威克汉姆酵母。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中异常威克汉姆酵母的含量不低于1.0×106cfu/mL或1.0×106cfu/g。
4.一种生产2-苯乙醇的方法，其特征在于，以L-苯丙氨酸为底物，以权利要求1所述异常威克汉姆酵母为发酵菌株，或添加权利要求2或3所述微生物菌剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将OD600为0.1～4的异常威克汉...
【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，田淑芳，陈宇，陈坚，曾伟主，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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