一种细胞内顺铂检测探针及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，先通过将亚硝酸钠溶液与含有浓盐酸的邻乙烯基醚苯胺的50%乙醇水溶液中反应得到重氮盐；再缓慢滴加溶有腙的吡啶溶液，待滴加完全后继续反应三小时；用二氯甲烷和水对溶液进行萃取反应，有机层合并后用稀盐酸洗涤并用无水硫酸钠干燥；减压并蒸馏去除溶剂再柱层析分离得到黄色粉末的产物为二芳基四氮唑；将顺铂及反应催化剂加入溶解到DMF溶液中,另外将二芳基四氮唑加入溶解于DMF溶液中；混合反应后经过蒸馏及柱层析得到终产物即为顺铂二芳基四氮唑配合物；本发明专利技术的技术方案能够提供一种制备工艺合理、合成稳定可靠且可在细胞中用于检测顺铂实时动态变化情况的细胞内顺铂检测探针及其制备方法。

【技术实现步骤摘要】
一种细胞内顺铂检测探针及其制备方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种细胞内顺铂检测探针及其制备方法。
技术介绍
顺铂（Cisplatin，CDDP)是目前肿瘤化疗中常用的金属铂类络合物，其在肿瘤治疗中有重要意义。顺铂具有抗癌谱广、乏氧细胞有效、作用性强等优点，已普遍用于治疗睾丸癌、卵巢癌、子宫癌、膀胱癌、颈部癌、前列腺癌、脑癌等，疗效显著。顺铂进入癌细胞中可与DNA链交叉连接，造成DNA损伤，破坏DNA复制和转录，高浓度时也抑制RNA及蛋白质的合成。目前通过顺铂与不同的化合物形成配合物也发现了很多抗肿瘤效果更加明显的配合物；但目前还缺乏一种高效可控且可实时检测顺铂在细胞内动态变化情况的有效方法，这不利与顺铂作用机制的深入研究。光点击反应是指在紫外光或者可见光光源激发快速、高选择性的发生反应，二芳基四氮唑与碳碳双键间在温和的紫外光照下在水溶液中可发生快速的环合反应，是一类较为高效的光点击反应。首先，二芳基四氮唑在紫外光照的条件下脱去一分子氮气，形成腈亚胺的1，3-偶极子结构，1，3-偶极子选择性地被烯烃捕获，发生环加成反应生成吡唑啉产物。值得注意的是，二芳基四氮唑的分子内存在烯基醚结构时，在紫外灯的光照条件下可以发生分子内的光点击反应，产生具有荧光性质的吡唑啉结构。因此，基于该结构的荧光可控的性质，可以用于对顺铂的实时监控。
技术实现思路
本专利技术目的是为了克服现有技术的不足而提供一种制备工艺合理、合成稳定可靠且可在细胞中用于检测顺铂实时动态变化情况的细胞内顺铂检测探针及其制备方法。下面关于后续技术方案表述中涉及的专业名词解释如下：CDDP是指顺铂，属于金属铂类络合物。DMF是指二甲基甲酰胺，属于一种有机化合物，为无色透明液体，能和水及大部分有机溶剂互溶。为达到上述目的，本专利技术采用了如下技术方案。一种细胞内顺铂检测探针，其分子结构如下：。一种细胞内顺铂检测探针的制备方法，具体反应式及步骤如下：步骤S1：先通过将亚硝酸钠溶液倒入含有浓盐酸的邻乙烯基醚苯胺的50%乙醇水溶液中，充分反应制备得到重氮盐；步骤S2：向所述步骤S1得到的重氮盐中缓慢滴加溶有腙的吡啶溶液，控制反应温度在-10℃至-15℃，待滴加完全后继续反应三小时；步骤S3：用二氯甲烷和水对所述步骤S2的溶液进行萃取反应，有机层合并后用稀盐酸洗涤并用无水硫酸钠干燥；步骤S4：通过对所述步骤S3的产物进行减压并蒸馏去除溶剂后，再通过柱层析分离得到黄色粉末的产物为二芳基四氮唑；步骤S5：将顺铂及反应催化剂加入溶解到DMF溶液中,在50℃环境下搅拌反应24小时，另外将所述步骤S4得到的二芳基四氮唑加入溶解于另一组DMF溶液中；步骤S6：将所述步骤S5进行溶解后的顺铂及反应催化剂溶液滴加入到溶解有二芳基四氮唑的DMF溶液中，在50℃环境下搅拌反应24小时，再进行减压蒸馏去除溶剂后，通过柱层析提出得到黄色粉末的终产物即为顺铂二芳基四氮唑配合物。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤S1中亚硝酸钠溶液加入反应的温度条件控制在5℃以下。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤S5中反应催化剂采用的是硝酸银。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤S5中顺铂与反应催化剂加入反应重量配比为2：1。所述细胞内顺铂检测探针在抑制肿瘤细胞增殖中的应用，具体是通过将顺铂配合物探针与肿瘤细胞进行共孵育，再对肿瘤细胞内的增殖能力进行定量分析。所述细胞内顺铂检测探针在监测细胞中顺铂动态的应用，具体是将顺铂配合物探针与肿瘤细胞进行共孵育，通过手提式紫外灯的紫外光源的激发实时追踪顺铂在细胞中的位置。由于上述技术方案的运用，本技术方案具有的有益技术效果：（1）本技术方案的探针结构中的顺铂部分可以与DNA交联形成配合物从而发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用，还可以与顺铂通过配位键形成稳定的配位化合物，并且该结构的化合物保持顺铂的生物学功能；（2）本探针分子可以在紫外光的激发条件下发生光点击反应生成吡唑啉荧光基团，从而可以实现实时检测顺铂在细胞中的动态；（3）本专利技术采用的方法制备顺铂配合物探针，可实现并将其应用于肿瘤细胞的增殖抑制以及实时监测细胞中顺铂动态；（4）将顺铂配合物探针与肿瘤细胞进行共孵育，可以达到实现对肿瘤细胞内的增殖能力进行定量分析的有益技术效果；（5）本探针将顺铂配合物探针与肿瘤细胞进行共孵育，可以实现通过手提式紫外灯的紫外光源的激发达到实时追踪顺铂在细胞中位置情况的技术效果。附图说明图1为本专利技术探针分子的制备整体反应流程示意图。图2为本专利技术顺铂配合物探针的肿瘤细胞增值抑制分析示意图。图3为本专利技术顺铂配合物探针的肿瘤细胞荧光成像分析示意图。具体实施方式下面结合附图1-3及具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明。（一）顺铂配合物探针探针的制备：通过将2ml冷的亚硝酸钠溶液（5mmol）在5℃以下倒入含有1.3ml浓盐酸的邻乙烯基醚苯胺（1g,5mmol）的50%乙醇水溶液中制备得到重氮盐；将重氮盐缓慢滴加到30ml溶有腙(1.6g,5mmol)的吡啶溶液中，控制反应温度在-10℃至-15℃滴加完全后继续反应3小时后，用二氯甲烷和水萃取反应，有机层合并后用稀盐酸洗涤并用无水硫酸钠干燥；减压蒸馏去除溶剂后，通过柱层析提出得到黄色粉末的产物为二芳基四氮唑。该产物二芳基四氮唑通过核磁氢谱验证：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.66–8.73(m,2H),8.11(d,J=8.4Hz,2H),8.01–7.91(m,1H),7.55-7.6(m,1H),7.13(m,2H),5.85-5.9(m,1H),5.2(m,1H),5.3-5.35(m,1H),4.14-4.19(m,2H)。称取顺铂40mg以及硝酸银20mg,加入DMF2ml,50℃搅拌24小时；加入二芳基四氮唑38mg溶解于2mlDMF中，将上述顺铂溶液滴加入50℃搅拌24小时；减压蒸馏去除溶剂后，通过柱层析提出得到黄色粉末的终产物顺铂二芳基四氮唑配合物。该终产物顺铂二芳基四氮唑配合物通过核磁氢谱验证：1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.11-9.15(m,2H),8.21-8.25(d,J=8.4Hz,2H),7.76-7.7(m,1H),7.65-7.68(m,1H),7.4-7.43(m,1H),7.157.2(m,1H),5.85-5.9(m,1H),5.25-5.3(m,2H),4.74-4.79(m,2H)，4.35-4.39(m,2H)。（二）顺铂配合物探针对肿瘤细胞的抑制作用：将HeLa细胞植入96孔板中，待细胞密度达到80%，加入0-10ug/ml不同浓度的顺铂配合物探针，分别共培养48小时后，采用噻唑蓝（MTT）对细胞存活进行检测：每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml），继续培养4小时，小心吸去孔内培养液，孔加入150ulDMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞内顺铂检测探针，其特征在于，其分子结构如下：/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞内顺铂检测探针，其特征在于，其分子结构如下：

。


2.根据权利要求1所述的一种细胞内顺铂检测探针，其特征在于：所述细胞内顺铂检测探针在抑制肿瘤细胞增殖中的应用，具体是通过将顺铂配合物探针与肿瘤细胞进行共孵育，再对肿瘤细胞内的增殖能力进行定量分析。


3.根据权利要求1所述的一种细胞内顺铂检测探针，其特征在于：所述细胞内顺铂检测探针在监测细胞中顺铂动态的应用，具体是将顺铂配合物探针与肿瘤细胞进行共孵育，通过手提式紫外灯的紫外光源的激发实时追踪顺铂在细胞中的位置。


4.根据权利要求1所述的一种细胞内顺铂检测探针的制备方法，其特征在于，具体反应式及步骤如下：



步骤S1：先通过将亚硝酸钠溶液倒入含有浓盐酸的邻乙烯基醚苯胺的50%乙醇水溶液中，充分反应制备得到重氮盐；
步骤S2：向所述步骤S1得到的重氮盐中缓慢滴加溶有腙的吡啶溶液，控制反应温度在-10℃至-15℃，待滴加完全后继续反应三小时；
步骤S3：用二氯甲烷和水对所述步骤S2的溶液进行萃取反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄磊，童坤，肖潇，
申请(专利权)人：江苏申基生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32