一种培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3D模型的方法技术

本发明专利技术公开了一种培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3D模型的方法，属于生物医药技术领域。该方法包括以下步骤：1)获取肺癌肿瘤组织，消化肿瘤组织，分离形成单细胞悬液；2)细胞计数并将细胞悬液与基质胶重悬，接种于细胞培养板，转移至培养箱，凝固基质胶；3)加入肺癌类器官条件培养基完全没过基质胶进行培养至得到人肺癌类器官3D模型；肺癌类器官条件培养基包括DMEM/F‑12基础培养基和添加因子。应用该方法所建立的人肺癌类器官3D模型可广泛应用于其他肺癌靶向药物的体外高通量筛选，相对于传统PDO及PDX模型更加准确、高效和快速。

【技术实现步骤摘要】
一种培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3D模型的方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3D模型的方法。
技术介绍
2018GLOBOCAN及中国癌症中心的数据显示，肺癌的发病率和死亡率均居全球癌症之首。中国肺癌每年新发病例约78万，因肺癌导致死亡人数约为63万。对于大部分晚期非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)患者，顺铂(cisplatin)是有效并广泛应用的一线化疗药物。尽管近几年肺癌化疗有了长足的进步，但是预后仍然不容乐观。过去25年肺癌患者化疗后的5年生存率仍未见显著提高，仅为15％。长期化疗导致的耐药性，是影响肺癌患者整体治疗效果，导致化疗失败的主要原因之一。因此，深入地开展肺癌化疗耐药机制的研究及针对性地开发新的靶向药物是我们迫切需要解决的问题，对提高肺癌患者的治疗和生存率具有重要的临床现实意义。然而从基础科研研究到临床实际治疗的转化成了开发肺癌治疗新药的主要障碍之一。传统肿瘤研究模型包括肿瘤细胞系(patient-derivedcancercelllines，PDC)及人体肿瘤组织小鼠移植模型(patient-derivedxeografts，PDX)面临的弊端日益显露，包括瘤细胞异质性和瘤细胞体内特征的丢失，肿瘤移植成功率低、肿瘤样本量大和实验周期较长在内的诸多问题。类器官技术被Science杂志评选为2013年科技发展的十大突破之一，研究者们利用该技术成功建立了肿瘤类器官模型(patient-derivedorganoids，PDO)。PDO主要是利用患者肿瘤组织进行体外3-D培养用于模拟体内肿瘤组织的生物学特征，为个性化癌症治疗开辟了新的视野。2019年SeJinJang等利用肺癌患者的肿瘤组织进行3-D培养，建立了肺癌类器官库。并且研究结果证明肺癌类器官作为肺癌患者药物筛选和个体化治疗的可行性，是肺癌化疗耐药机制研究及个体化靶向药物研发的理想模型。然而目前国内尚没有建立关于肺癌组织类器官培养的成熟方法，成功在体外构建肺癌组织类器官培养体系，将能够很好地模拟体内肺癌肿瘤组织的生长特点和微环境，相对2D体外细胞培养更能客观地反映体内肺癌肿瘤组织对药物的反应过程；并且相对动物模型能在短期内完成肺癌疾病模型的建立和药物筛选平台的构建，及时快速地进行药物敏感性检测与药物筛选，为肺癌患者药物研发提供理想体外模型。Nrf2信号通路是引起肺癌细胞增殖和耐药的重要信号通路，可作为提高肺癌患者对化疗药物敏感性的潜在靶点。目前大部分Nrf2抑制剂都是从中草药中发现并分离出来的，然而这些Nrf2天然抑制剂其潜在的细胞毒性效应并非依赖针对Nrf2的特异性抑制作用，而是由于其广谱的蛋白翻译抑制特性，并且这些Nrf2天然抑制剂还未得到临床应用。因此开发有效的Nrf2特异性抑制剂并将其应用于临床，这是我们迫切需要探讨的问题。在最近的一项AnjuSingh的研究中，作者通过利用NSCLC肺腺癌细胞系(A549)对MLSMR药物库中400000种临床化合物进行高通量筛选，发现ML385能通过与转录因子Nrf2的DNA结合域特异性结合，抑制其下游靶基因的转录与表达。然而作为Nrf2特异性抑制剂，ML385能否在与化疗药联合应用时促进肺癌细胞对于化疗药物的敏感性及其具体机制，这方面的研究国内尚未见报道。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3D模型的方法；本专利技术所要解决的另一技术问题是提供一种人肺癌类器官3D模型的体外培养基；本专利技术所要解决的最后一个技术问题是提供人肺癌类器官3D模型的在肺癌靶向药物的体外高通量筛选与抗肺癌药物敏感性评价中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3D模型的方法，包括以下步骤：1)获取肺癌肿瘤组织，消化肿瘤组织，分离形成单细胞悬液；2)细胞计数并将单细胞悬液与基质胶重悬，接种于细胞培养板，转移至培养箱，凝固基质胶；3)加入肺癌类器官条件培养基并完全没过基质胶，培养至得到人肺癌类器官3D模型；肺癌类器官条件培养基包括DMEM/F-12基础培养基和添加因子，添加因子包括Glutamax、HEPES、Antibiotic-Antimycotic、B-27Supplement、N-Acetyl-L-cysteine、EGF、FGF-10、FGF-4、Noggin、A83-01和Y-27632。进一步的，步骤1)中，肺癌肿瘤组织为新鲜离体的肺癌肿瘤组织，消化肿瘤组织为用胶原酶和胰酶消化肿瘤组织。进一步的，步骤1)中，获取新鲜离体的肺癌肿瘤组织，冰上剪碎并用冷PBS缓冲液冲洗，用胶原酶消化肿瘤组织1小时并继而用胰酶37℃消化肿瘤组织10分钟，形成单细胞悬液。进一步的，步骤2)中，细胞计数并将单细胞悬液与基质胶重悬，按50μL每孔接种于细胞培养板，随后将细胞培养板转移至培养箱，37℃10-20分钟，凝固基质胶。进一步的，步骤3)中，肺癌类器官条件培养基的培养条件为于37℃，5％CO2条件下维持培养。所述添加因子为：2mMGlutamax、10mMHEPES、100U/mLAntibiotic-Antimycotic、1XB-27Supplement、1.25mMN-Acetyl-L-cysteine、50ng/mLEGF、100ng/mLFGF-10、100ng/mLFGF-4、100ng/mLNoggin、0.5μMA83-01和10μMY-27632。所述生物医药功能研究包括肺癌靶向药物的体外高通量筛选、抗肺癌药物敏感性评价等。所述培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3D模型的方法获得的人肺癌类器官3D模型。所述的人肺癌类器官3D模型在肺癌靶向药物的体外高通量筛选中的应用。所述的人肺癌类器官3D模型在抗肺癌药物敏感性评价中的应用。有益效果：相比于现有技术，本专利技术的优点为：本申请公开了一种培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3D模型的方法，应用该方法所建立的人肺癌类器官3D模型分析ML385对肺癌细胞化疗敏感性，发现人肺癌类器官单独顺铂刺激组在顺铂浓度达到5μM时才可见明显的细胞坏死，而顺铂联合ML385组在顺铂浓度达到1μM时即可见明显的细胞坏死，促进了Nrf2通路特异性抑制剂ML385对肺癌细胞的化疗敏感性。该模型可广泛应用于其他肺癌靶向药物的体外高通量筛选，相对于传统PDO及PDX模型更加准确、高效和快速。附图说明图1是收集临床肺癌患者手术切除肿瘤标本制作成体外培养的肺癌类器官的技术线路图；图2是人肺鳞癌类器官的体外倒置显微镜显示最佳冻存期及复苏照片图；图3是对成功建立的肺癌类器官进行体外连续培养15天，明视野倒置显微镜下观察肺癌类器官的形态图；图4是对人肺癌患者肿瘤组织及对应类器官的HE及本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3D模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)获取肺癌肿瘤组织，消化肿瘤组织，分离形成单细胞悬液；/n2)细胞计数并将单细胞悬液与基质胶重悬，接种于细胞培养板，转移至培养箱，凝固基质胶；/n3)加入肺癌类器官条件培养基并完全没过基质胶，培养至得到人肺癌类器官3D模型；/n所述肺癌类器官条件培养基包括DMEM/F-12基础培养基和添加因子，所述添加因子选自Glutamax、HEPES、Antibiotic-Antimycotic、B-27 Supplement、N-Acetyl-L-cysteine、EGF、FGF-10、FGF-4、Noggin、A 83-01和Y-27632。/n

【技术特征摘要】
1.一种培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3D模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)获取肺癌肿瘤组织，消化肿瘤组织，分离形成单细胞悬液；
2)细胞计数并将单细胞悬液与基质胶重悬，接种于细胞培养板，转移至培养箱，凝固基质胶；
3)加入肺癌类器官条件培养基并完全没过基质胶，培养至得到人肺癌类器官3D模型；
所述肺癌类器官条件培养基包括DMEM/F-12基础培养基和添加因子，所述添加因子选自Glutamax、HEPES、Antibiotic-Antimycotic、B-27Supplement、N-Acetyl-L-cysteine、EGF、FGF-10、FGF-4、Noggin、A83-01和Y-27632。


2.根据权利要求1所述的培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3D模型的方法，其特征在于，步骤1)中，获取新鲜离体的肺癌肿瘤组织，冰上剪碎并用冷PBS缓冲液冲洗，用胶原酶消化肿瘤组织1小时并继而用胰酶37℃消化肿瘤组织10分钟，形成单细胞悬液。


3.根据权利要求1所述的培养专用于生物医药功能研究的人肺癌类器官3D模型的方法，其特征在于，步骤2)中，细胞计数并将单细胞悬液与基质胶重悬，按50μL每孔接种于细胞培养板，随后将细胞培养板转移至培养箱，37℃10-20分钟，凝固基质胶。

【专利技术属性】
技术研发人员：季俐俐，方译萱，薛群，张曙，李晶菁，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32