双特异性抗体制造技术

本申请提供双特异性抗体，其由单链单元和单价单元组成，其中该单链单元针对免疫细胞具有特异性，该单价单元针对肿瘤细胞或微生物具有特异性。该单链单元包含与Fc片段融合的单链可变片段(scFv)且该单价单元包含轻链和重链对。本申请还提供双特异性抗体的制备方法，这些抗体的药学用途和诊断用途。

【技术实现步骤摘要】
双特异性抗体本申请是国际申请号PCT/CN2012/084982，国际申请日2012年11月21日，中国申请号201280065551.5，专利技术名称为“双特异性抗体”专利申请的分案申请。
技术介绍
双特异性抗体(BsAb)为具有两种不同结合特异性的抗体或抗体类分子。BsAb广泛应用于生物医学，尤其是针对肿瘤的免疫治疗中。目前，对于免疫治疗研究的一个关注焦点为如何利用BsAb的细胞介导的细胞毒性来杀死肿瘤细胞。BsAb可设计为同时靶向作用于肿瘤细胞和效应细胞，同时激发效应细胞使其杀灭肿瘤细胞。BsAb可通过例如化学工程、细胞工程以及基因工程的方法制备。基因工程的优势在于能够容易地改造抗体，使得能够设计和生产许多不同形式的双特异性抗体片段，包括双体，串联的(tanderm)ScFv和单链双体及其衍生物(参见Jin和Zhu，于“thedesignandengineeringofIgG-Likebispecificantibodies”，REKontermann(编)，Bispecificantibodies)。由于这些BsAb不具有IgGFc结构域，因此它们的小的尺寸使得它们渗透进入肿瘤的能力增强，但它们在体内具有相当短的半衰期并且缺乏ADCC作用，该作用与抗体的恒定区相关联。为了增强稳定性和治疗能力，对重链进行重组基因改造以促进它们的异二聚化并获得较高的含Fc的IgG类双特异性抗体的产量。已经有几种合理的设计方案用于改造抗体CH3链用于异二聚化，即，二硫键、盐桥、杵-臼(knobs-into-holes)。在并置的位置处产生杵(knob)和臼(hole)的基础在于该杵和臼相互作用将有助于形成异二聚体，然而杵-杵和臼-臼相互作用因有利的相互作用缺失而不利于形成同二聚体。尽管该杵-臼方案解决了重链同二聚化问题，但这没有解决来自两种不同抗体的轻链和重链之间的错配问题。虽然有可能对于两种不同抗体识别相同的轻链，但使用具有相同轻链的两种抗体序列构建BsAb的可能性非常小。因此需要提供更好的易于制备的BsAb，并且该BsAb具有较好的临床稳定性和效力和/或减弱的系统毒性。
技术实现思路
技术问题本申请的一个实施例提供了一种抗体，该抗体包含：(a)轻链-重链对，该轻链-重链对针对肿瘤细胞或微生物具有特异性；和(b)融合肽，该融合肽包含单链可变片段(scFv)和具有CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽针对免疫细胞具有特异性。技术解决方案在某些方面，该轻链-重链对针对肿瘤抗原具有特异性。一方面，该肿瘤抗原选自：EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、叶酸盐结合蛋白、6D2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素(Integrin)、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和肌腱蛋白(Tenascin)。一方面，该轻链-重链对针对较对应的非肿瘤细胞而言在肿瘤细胞上过表达的蛋白具有特异性。在某些方面，该轻链-重链对针对病毒或细菌具有特异性。一方面，该轻链-重链对针对内毒素具有特异性。在某些方面，该免疫细胞选自T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞和肥大细胞。在某些方面，该融合肽针对以下抗原具有特异性，该抗原选自CD3、CD16、CD19、CD28和CD64。在某些方面，该轻链通过二硫键与该重链结合。在某些方面，该重链通过一个或多个二硫键与该融合肽结合。一方面，该重链包含人或者人源化的(humanized)Fc片段。一方面，该重链的Fc片段包含人IgGFc片段。一方面，该融合肽的Fc片段包含人或者人源化的Fc片段。一方面，该融合肽的Fc片段包含人IgGFc片段。在某些方面，与野生型抗体片段相比，该重链和/或该融合肽的Fc片段包含一处或多处替换，该替换在该重链和Fc片段之间形成离子键。一方面，这些替换选自表1。在某些方面，与野生型抗体片段相比，该重链和/或该融合肽的Fc片段包含一处或多处替换，该替换在该重链和Fc片段之间形成杵-臼结构配对。一方面，这些替换选自表2。在某些方面，该CH2结构域位于该scFv片段和CH3结构域之间。一方面，该融合肽不包含CH1结构域。在一个实施例中，本申请还提供一种包含上述任一实施例中的抗体的组合物。一方面，载体为药物载体。另一实施例提供了一种复合体，该复合体包含与一个或多个抗原结合的上述任一实施例中的抗体。本申请进一步提供了一种抗体的制备方法，该方法包括：将(a)轻链-重链对和(b)融合肽混合，该轻链-重链对针对免疫细胞具有特异性，且该融合肽包含单链可变片段(scFv)和具有CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中该融合肽对于肿瘤细胞具有特异性。一方面，本申请提供一种可通过该方法获得的抗体。附图说明图1显示了本申请的双特异性抗体的一个实施例的结构；图2显示了图1双特异性抗体的每条链的表达载体的构造；图3为1％琼脂糖凝胶电泳图：泳道M：DL2000指示物(marker)；泳道1：赫赛汀(Herceptin)VH；泳道2：赫赛汀VL；泳道3：人IgG1CH区域(CHi+铰链+Fc)；泳道4：人IgCL；图4为1％琼脂糖凝胶电泳图：泳道M：DL1000DNA指示物；泳道1：人源化的OKT3(HOKT3)VH-接头；泳道2：接头-HOKT3VL；图5为1％琼脂糖凝胶电泳图：泳道M：DL10000DNA指示物；泳道1：HOKT3单链；图6-8为用于定点诱变的质粒的限制图谱；图9显示了6％凝胶SDS-PAGE图和蛋白质印记(Westernblot)图。样品为293F细胞上清液。泳道M：蛋白指示物；泳道1：赫赛汀mAb；泳道2：T366W修饰的HOKT3单链+Y407A修饰的赫赛汀重链+赫赛汀轻链；泳道3：T366WK392D和K409D修饰(TKK)的HOKT3单链+D356KD399KY407A修饰(DDY)的赫赛汀重链+赫赛汀轻链；泳道4：K392D和K409D修饰(KK)的HOKT3单链+D356KD399K修饰(DD)的赫赛汀重链+赫赛汀轻链；泳道5：T366WK392D和K409D修饰(TKK)的HOKT3单链+L368RD399KY407A修饰(LDY)的赫赛汀重链+赫赛汀轻链；泳道6：T366WK392D和K409D修饰(TKK)的HOKT3单链+D399KY407A修饰(DY)的赫赛汀重链+赫赛汀轻链；图10显示了6％SDS-PAGE凝胶电泳，并用考马斯亮蓝染色结果，该图显示：泳道M：蛋白标记物；泳道1：纯化的MSBODY；泳道2：赫赛汀；泳道3：HOKT3单链；图11显示了抗Her2X抗CD3MSBODY结合至BT474细胞(A)和外周血单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体，包含：/n(a)针对肿瘤细胞或微生物有特异性的轻链-重链对；和/n(b)融合肽，所述融合肽包含单链可变片段(scFv)和具有CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中所述融合肽针对免疫细胞具有特异性。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗体，包含：
(a)针对肿瘤细胞或微生物有特异性的轻链-重链对；和
(b)融合肽，所述融合肽包含单链可变片段(scFv)和具有CH2结构域和CH3结构域的Fc片段，其中所述融合肽针对免疫细胞具有特异性。


2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链-重链对针对肿瘤抗原具有特异性。


3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述肿瘤抗原选自：EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、粘蛋白、TAG-72、CIX、PSMA、叶酸盐结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、整合素、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和肌腱蛋白。


4.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链-重链对针对在肿瘤细胞上相对于对应的非肿瘤细胞过表达的蛋白具有特异性。


5.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述轻链-重链对针对病毒或者细菌具有特异性。


6.根据权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述轻链-重链对针对内毒素具有特异性。


7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗体，其特征在于，所述免疫细胞选自T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、吞噬细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体，其特征在于，所述融合肽针对选自CD3、CD16、CD19、CD28和CD64的抗原具有特异性。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体，其特征在于，所述轻链通过二硫键与所述重链结合。


10.根据权利要求1-9中任一项所述的抗体，其特征在于，所述重链通过一个或多个二硫键与所述融合肽结合。


11.根据权利要求1-10中任一项所述的抗体，其特征在于，所述重链包含人或者人源化的Fc片段。


12.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：周鹏飞，张敬，严永祥，
申请(专利权)人：武汉友芝友生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42