心力衰竭检测方法、心力衰竭检测用器具、夹心免疫检测法以及抗体的组合技术

[所要解决的问题]简单且高精度地对心力衰竭进行检测等。[解决问题的技术方案]提供一种使用了从活体采集的样本的心力衰竭检测方法，其通过使用表位为NT‑proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT‑proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体对上述样本中含有的NT‑proANP或其片段实施夹心免疫检测，来检测心力衰竭。捕获用抗体和标记用抗体这两种抗体的表位都在NT‑proANP的氨基酸序列31～67位中，因此，即使在NT‑proANP在血液循环中被进一步切断三部分的情况下，也能够检测出与切断分解前的NT‑proANP相同物质量的片段。因此，能够简单且高精度地测定活体样本中的NT‑proANP并检测出心力衰竭。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】心力衰竭检测方法、心力衰竭检测用器具、夹心免疫检测法以及抗体的组合
本专利技术涉及使用了表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体的心力衰竭检测方法、心力衰竭检测用器具、夹心免疫检测法、两抗体的组合等。
技术介绍
心力衰竭(heartfailure)是心脏的血液输出不足、无法保证全身所需的循环量的病症。多数影响心脏的疾病、例如先天性心脏病、心脏瓣膜病(例如二尖瓣关闭不全、三尖瓣关闭不全、主动脉瓣关闭不全、肺动脉瓣关闭不全等)、心肌疾病(例如扩张性心肌病、肥厚性心肌病、心肌炎等)、盘尾丝虫病、血管疾病(例如血栓、塞栓、动脉硬化等)、高血压症等都是引发心力衰竭的原因。心力衰竭多数情况下在初期病状中几乎不会表现出明显的症状，之后，经过数日、有时为数年，呼吸急促、疲劳等症状会逐渐明显。心力衰竭症状有时会稳定较长时间，但在不知不觉间慢慢发展的情况也很多。总体而言，心力衰竭是一种如不进行充分治疗病情就会逐渐加重的进行性疾病，预后也多数不佳，因此早期发现至关重要。ANP(Atrialnatriureticpeptide；心房利钠肽)是一种由28个氨基酸组成的具有生理活性的肽。ANP在心房体液量增加、内压上升等的刺激下由心房肌细胞等分泌至血液中。作为激素发挥作用，以肾脏、血管等为靶器官，具有强效的排钠利尿作用、以及舒张血管和降血压作用。但是，其在血液中的半衰期约为100秒，难以测定其血中浓度。ANP在心房肌细胞等中被生物合成为其前体proANP(Proatrialnatriureticpeptide：前心房利钠肽)。ANP的前体proANP由126个氨基酸组成，由氨基酸序列1～98位的NT-proANP(N-terminalproANP)和氨基酸序列99～126位的ANP组成。在由心房肌细胞等分泌到血液中时，被切断为NT-proANP和ANP。已知在人、犬等患有充血性心力衰竭等时，血液中的ANP会增加；因此，ANP作为心力衰竭等的标志物是有用的。但是，如上所述，ANP在血液中的稳定性较低，其半衰期较短，因此，难以简易且高精度地测定。故而，人们尝试使用血液中的NT-proANP来替代ANP作为心力衰竭等的标志物，并提出了各种建议。例如，专利文献1中记载了使用对N肽的氨基酸序列43～66位进行识别的第一抗体或第二抗体的夹心免疫检测法等；专利文献2中记载了使用对NT-proANP的氨基酸序列53～72位进行识别的第一抗体和对该序列73～90位进行识别的第二抗体的夹心免疫分析等；专利文献3中记载了使用对犬NT-proANP的氨基酸序列31～40位进行识别的抗体和对该序列74～82位进行识别的抗体的免疫学测定方法以及犬的心脏疾病检测方法等。此外，非专利文献1中还记载了人的NT-proANP在血液循环中会进一步被切断分解为氨基酸序列1～30位、该序列31～67位、该序列79～98位这三部分；以及人的NT-proANP的氨基酸序列31～67位的片段作为充血性心力衰竭的标志物，敏感度最高。现有技术文献专利文献专利文献1：日本公开专利公报特开平8-226919号公报专利文献2:日本公开专利公报特表2006-523298号公报专利文献3:日本公开专利公报特开2014-210761号公报非专利文献1:SreedeviDaggubati,JamesR.Parks,RoseM.Overton,GuillermoCintron,DouglasD.Schocken,DavidL.Vesely,"Adrenomedullin,endothelin,neuropeptideY,atrial,brain,andC-natriureticprohormonepeptidescomparedasearlyheartfailureindicators".CardiovascularResearch(36)246-255,1997
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的目的在于更加简单且高精度地对心力衰竭进行检测等。用于解决问题的技术方案本专利技术者们独立发现，在血液循环中，实际上，NT-proANP几乎不会保持全长，很可能在早期就变为片段，同时，基于这一见解，尝试制作了表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位且表位互不重叠的两种抗体并获得了成功，而且还证实，通过使用这些抗体实施夹心免疫检测，能够简单且高精度地测定活体样本中的NT-proANP并检测出心力衰竭。因此，在本专利技术中，提供一种使用了从活体采集的样本的心力衰竭检测方法，其通过使用表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体对上述样本中含有的NT-proANP或其片段实施夹心免疫检测，来检测心力衰竭。在本专利技术中，捕获用抗体和标记用抗体这两种抗体的表位都在NT-proANP的氨基酸序列31～67位中，因此，即使在NT-proANP在血液循环中被进一步切断分解为氨基酸序列1～30位、该序列31～67位、该序列68～98位这三部分的情况下，也能够检测出与切断分解前的NT-proANP相同物质量的片段。因此，通过使用这些抗体的组合对NT-proANP或其片段实施夹心免疫检测，能够简单且高精度地测定活体样本中的NT-proANP并检测出心力衰竭。作为夹心免疫检测法，可以采用免疫层析法。使用免疫层析法，更具体而言，例如按照(1)向液体因毛细现象而扩展的流路的上游侧供给上述样本的步骤、以及(2)一边使上述液体从上述流路的上游侧向下游侧扩展一边使上述样本依次通过用标记物质标记了的上述第二抗体被保持的第一区域和上述第一抗体被固定在上述流路上的第二区域的步骤测定上述样本中含有的NT-proANP或其片段，由此，实质上通过仅是向流路的上游侧供给样本这样的简单作业就能测定NT-proANP并检测出心力衰竭。另外，该方法能够作为结构比较简单的器具实现，该器具的量产也较容易，因此能够对众多个体较为简单且价格低廉地实施心力衰竭的检查和检测，通用性较高。本专利技术既能用于对包括人在内的哺乳动物的心力衰竭的检测，也能有效地检测非人类哺乳动物、例如犬或猫的心力衰竭。例如，犬或猫中存在二尖瓣关闭不全、心肌病、盘尾丝虫病等严重且发生频率较高的心脏疾病，为了早期发现这些疾病，极需早期发现心力衰竭。另一方面，非人类哺乳动物的情况下，因其个体自身无法自行阐述不适，因此只能通过饲养者的观察、定期诊断等发现心力衰竭的细微征兆，与人相比，多数情况下早期发现尤为困难。对此，本专利技术按照仅是利用从这些个体采集的样本实施夹心免疫检测这样简单的步骤就能高精度地检测出心力衰竭，对非人类哺乳动物的心力衰竭检测有用性尤其高。专利技术效果采用本专利技术，能够简单且高精度地检测出心力衰竭。具体实施方式＜本专利技术的抗体组合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种心力衰竭检测方法，使用了从活体采集的样本，其中，/n使用表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体对所述样本中含有的NT-proANP或其片段实施夹心免疫检测，来检测心力衰竭。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180413 JP 2018-0777081.一种心力衰竭检测方法，使用了从活体采集的样本，其中，
使用表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的捕获用第一抗体和表位为NT-proANP的氨基酸序列31～67位中任一部位的标记用第二抗体对所述样本中含有的NT-proANP或其片段实施夹心免疫检测，来检测心力衰竭。


2.根据权利要求1所述的心力衰竭检测方法，其中，
上述第二抗体的表位不是与上述第一抗体重叠的部位。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的心力衰竭检测方法，其中，
使用免疫层析法，测定上述样本中含有的NT-proANP或其片段。


4.根据权利要求3所述的心力衰竭检测方法，其中，
包括向液体因毛细现象而扩展的流路的上游侧供给上述样本的步骤、
以及一边使上述液体从上述流路的上游侧向下游侧扩展一边使上述样本依次通过用标记物质标记了的上述第二抗体被保持的第一区域和上述第一抗体被固定在上述流路上的第二区域的步骤。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的心力衰竭检测方法，其中，
检测犬、猫或人的心力衰竭。


6.一种心脏肥大的检测方法，所述心脏肥大是心力衰竭发展程度的指标，其中，

【专利技术属性】
技术研发人员：宇田友彦，北山咲园子，石井健容，
申请(专利权)人：共立制药股份有限公司，
类型：发明
国别省市：日本;JP