基于苯硼酸定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及基于苯硼酸定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备方法，该免疫磁吸附剂利用抗体Fc片段糖蛋白分子中的顺式二醇结构与苯硼酸基团特异性的亲和作用实现抗体定向偶联在磁载体表面。与传统方法相比，本方法最大程度地提高抗体Fab端的利用率，进而提高免疫磁吸附剂对目标物的亲和力与吸附能力，并能有效控制批间差，值得进一步推广使用。所制备的免疫磁吸附剂可用于对多种食品样本的检测前处理，根据所偶联抗体的不同可用于食品样本中危害物质如真菌毒素、农兽药残留、重金属以及病原微生物等的富集和纯化。纯化后的危害物可用高效液相色谱、免疫分析方法以及酶联免疫技术等方法定量或定性检测。

【技术实现步骤摘要】
基于苯硼酸定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备方法
本专利技术属于食品安全检测和前处理
，具体地说，涉及基于苯硼酸定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备。
技术介绍
在食品危害因子的检测中，样品的分离、纯化等前处理步骤是必不可少的，是影响分析结果可靠性的关键环节。传统的样品前处理方法如液相萃取、固相萃取等，操作繁琐且特异性差，影响检测准确度。免疫亲和层析法基于配基与待检物之间的特异性识别，其准确度好，但成本高、耗时长。而基于免疫磁吸附剂的方法由于其特异性好、快速高效的优势，在食品安全检测样品前处理领域得到迅速发展。免疫磁吸附剂由具有超顺磁性的磁载体和修饰在磁载体上的抗体构成，通过抗体特异性识别作用将目标待检物捕获在磁载体表面，然后在外加磁场的作用下，实现对待检物的富集分离。目前免疫磁吸附剂制备方法的基本原理通常是通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)或戊二醛等作为偶联试剂将抗体修饰在羧基化或氨基化磁载体表面。但这种方法存在一个明显缺陷，即由于抗体Fab端(抗原识别区)和Fc端都具有大量的氨基，导致抗体在磁载体表面的取向随机不可控，这种随机取向减少了Fab端外露的数量，降低了抗体的有效利用率，导致抗体用量大、成本过高、磁分离效率偏低、磁分离可重复性和稳定性偏低等后果。因此，发展将抗体Fc端定向偶联在磁载体上的方法，使得抗原识别端Fab端外露，减少抗原与抗体结合的空间位阻，从而提高免疫磁吸附剂的抗原亲和力，提高待检物抗原的富集效率，有效控制批间差，同时降低成本，是本领域亟待解决的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术缺陷，提供基于苯硼酸定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备方法，所提供的免疫磁吸附剂表面抗体取向固定，抗原识别区Fab端外露。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供了一种基于苯硼酸定向偶联抗体的免疫磁吸附剂，包括磁载体和偶联在磁载体上的抗体，所述抗体通过磁载体表面苯硼酸基团与抗体Fc片段糖蛋白分子中的顺式二醇结构特异性的亲和作用定向偶联在磁载体表面。进一步地，所述磁载体为任意具有超顺磁性的微纳米粒子，优选磁载体为包裹Fe3O4纳米颗粒的聚合物微球或二氧化硅微球。进一步地，所述磁载体表面全部或部分为苯硼酸基团。本专利技术还提供了一种基于苯硼酸定向偶联抗体的免疫磁吸附剂的制备方法，首先制备表面修饰苯硼酸基团的磁载体，然后通过苯硼酸基团与与抗体Fc片段上糖蛋白分子中的顺式二醇结构特异性的亲和作用将抗体定向固定在磁载体上。具体工艺步骤如下所述：第一步，苯硼酸化磁载体的制备，方案可以是如下两种其中之一。磁载体制备方案之一，先合成表面羧基或氨基修饰的磁载体，再在其表面进行苯硼酸化修饰。比如，通过用EDC作为偶联剂将氨基苯硼酸修饰在羧基化磁珠表面制备苯硼酸化磁载体；或者通过EDC作为偶联剂将4-羧基苯硼酸修饰在氨基化磁珠表面制备苯硼酸化磁载体。磁载体制备方案之二，1)参见现有文献合成油溶性磁纳米颗粒；2)再通过对常见聚合物如聚苯乙烯马来酸酐(PSMA)、聚马来酸酐-十八烯共聚物(PMAO)等进行苯硼酸基团改性制备含苯硼酸基团的聚合物，例如，将3-氨基苯硼酸与聚马来酸酐十八醇酯在4-二甲氨基吡啶的催化下通过酰化反应合成含苯硼酸的聚合物；3)然后通过乳化-乳液溶剂挥发法将磁纳米颗粒封装在含苯硼酸基团的聚合物中制备苯硼酸化磁微球载体，具体地，将含有油溶性磁纳米颗粒、聚合物、某种挥发性非极性溶剂如甲苯、氯仿等作为油相，含表面活性剂如十二烷基硫酸钠的水溶液作为水相，通过超声、搅拌等方式乳化制备水包油乳液，随后将乳液滴中的非极性溶剂通过挥发或旋蒸等方式去除即得到苯硼酸化磁载体。第二步，抗体与磁载体的定向偶联。将第一步合成的苯硼酸化磁载体和抗体混合在缓冲液(0.02M磷酸盐缓冲液，pH为5.5-8.0，不同抗体最优pH不同)中于室温25℃孵育10～20min实现抗体的定向偶联，而后加入葡萄糖或OVA溶液继续室温孵育10～20min以封闭磁载体上多余的苯硼酸基团，待反应结束后通过磁分离获得抗体定向偶联的免疫磁吸附剂。本专利技术提供的免疫磁吸附剂可用于对多种食品样本进行检测前处理，根据所偶联抗体的不同可用于食品样本中危害物质如真菌毒素、农兽药残留、重金属以及病原微生物等的富集和纯化。纯化后的危害物可用高效液相色谱、免疫分析方法等方法定量或定性检测。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：相对传统抗体非定向偶联的免疫磁吸附剂，本专利技术提供的基于苯硼酸定向偶联抗体的免疫磁吸附剂及其制备，将抗体的Fc端定向偶联到磁载体上，Fab端外露，减少抗原与抗体结合的空间位阻，从而提高免疫磁吸附剂的抗原亲和力，提高待检物抗原的富集效率，有效控制批间差，同时因可降低抗体用量而降低成本。附图说明图1为传统免疫磁吸附剂合成示意图；图2为基于苯硼酸定向偶联抗体的免疫磁吸附剂合成示意图。图3为聚马来酸酐十八醇酯修饰苯硼酸方案。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细说明，仅作为说明本专利技术具体内容而不用于限制本专利技术范围。实施例1本实施例基于苯硼酸定向偶联抗体沙门氏菌的免疫磁吸附剂的制备包括苯硼酸化磁载体的制备，抗体与磁载体的偶联，具体工艺步骤如下所述：1)苯硼酸化磁载体的制备，a.Fe3O4磁珠的合成，在500mL三口烧瓶中加入300mL超纯水，通入N2以除去水中氧气，同时在50℃预热15min。加入3.2gFeCl2·H2O，5.2gFeCl3磁力搅拌混匀后加入25mL氨水，黄色溶液迅速变为黑色，50℃恒温反应30min。将合成的磁珠通过磁吸分离，用超纯水洗3-5次直至磁吸后溶液pH至中性后复溶于300mL超纯水中。b.Fe3O4磁珠的油酸化修饰，将上步所合磁珠加入三口烧瓶中，通入N2，边搅拌边逐滴加入2.4mL油酸。由于油酸化的磁珠疏水，吸附于搅拌器或烧瓶壁上，70℃反应3h黑色溶液逐渐清澈，停止反应，倒掉烧杯中溶液，加入300mL乙醇将吸附的油酸化磁珠洗脱，磁吸2min弃去乙醇溶剂，重复此步骤3-5次直至乙醇液面无漂浮油酸层。c.磁微球的合成，通过乳化-乳液溶剂挥发法合成磁微球，将上步合成的油酸化磁珠分散在30mL环己烷中以形成油相，1.5g十二烷基硫酸钠(SDS)溶解在500mL超纯水中以形成水相，将上述混合物超声处理10min形成水包油微乳液。随后放置于60℃过夜挥发环己烷，得到SDS稳定的磁微球。重新将其分散于60mLTween-80溶液中，之后通过磁吸获得Tween-80修饰的磁微球。d.Fe3O4@SiO2复合纳米微球的合成，1000mL乙醇，30mL氢氧化铵，20mL超纯水和6mLTEOS于30℃预反应20min，使TEOS预水解。再将上步合成的60mL磁微球加入混合体系中，通过控制反应时间，得到包被合适厚度SiO2层的磁微球。e.Fe3O4@SiO2复合纳米微球表面进行羧基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于苯硼酸定向偶联抗体的免疫磁吸附剂，包括磁载体和偶联在磁载体上的抗体，其特征在于，所述抗体通过磁载体表面苯硼酸基团与抗体Fc片段糖蛋白分子中的顺式二醇结构特异性的亲和作用定向偶联在磁载体表面。/n

【技术特征摘要】
1.基于苯硼酸定向偶联抗体的免疫磁吸附剂，包括磁载体和偶联在磁载体上的抗体，其特征在于，所述抗体通过磁载体表面苯硼酸基团与抗体Fc片段糖蛋白分子中的顺式二醇结构特异性的亲和作用定向偶联在磁载体表面。


2.根据权利要求1所述的免疫磁吸附剂，其特征在于，所述磁载体为包裹Fe3O4纳米颗粒的聚合物微球或二氧化硅微球。


3.根据权利要求2所述的免疫磁吸附剂，其特征在于，所述纳米颗粒为Fe3O4纳米颗粒。


4.根据权利要求1所述的免疫磁吸附剂，其特征在于所述磁载体表面全部或部分为苯硼酸基团。


5.根据权利要求1-4任意一项所述的基于苯硼酸定向偶联抗体的免疫磁吸附剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)苯硼酸化磁载体的制备：先合成表面羧基或氨基修饰的磁载体，再在其表面进行苯硼酸化修饰，获得苯硼酸化磁载体；
或者，先合成油溶性磁纳米颗粒，然后将其封装在含苯硼酸基团聚合物中，获得苯硼酸化磁载体；
2)抗体的定向偶联：将抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：熊勇华，郭亮，冷远逵，黄小林，林童，李响敏，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36