一种评价化妆品对皮肤炎症舒缓或修复功效的方法技术

本发明专利技术涉及化妆品功效评价技术领域，针对现有化妆品舒缓皮肤炎症的评价方法中评价指标选取、处理的主观性较强，对评价结果带来主观因素干扰的问题，公开一种评价化妆品对皮肤炎症舒缓或修复功效的方法，包括以斑马鱼为受试对象，设置正常对照组、模型对照组、测试组，相同条件培养后置于荧光显微镜下拍照并保存图片，采用图像处理软件基于统计学方法统计斑马鱼的皮肤炎症部位的中性粒细胞个数；然后计算炎症舒缓或修复作用（%）。与现有方法相比，评价指标数据的选取、分析借助仪器和软件，而且评价结果可量化；斑马鱼饲养成本低，繁殖周期段，繁殖量大，使得评价方法具有高效、快速、成本低的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种评价化妆品对皮肤炎症舒缓或修复功效的方法
本专利技术涉及化妆品功效评价
，具体涉及一种评价化妆品对皮肤炎症舒缓或修复功效的方法。
技术介绍
目前市场上的部分化妆品宣称对皮肤炎症具有舒缓或修复功效，而对化妆品舒缓功效的评价方法有：物理化学法、生物化学法、细胞生物学法、三维重组皮肤模型替代法、动物实验法、主观评价法、半主观评价法、客观仪器评价法等。物理化学法：物理化学法是通过检测化妆品的物理性能和特定化学成分含量来评价其效果的便捷手段，目前在化妆品舒缓功效评价方面多为特定功效成分的定性定量检测。神经酰胺即N一脂酰基(神经)鞘氨醇，是人体皮肤脂质的重要成分，有保湿、维持角质层结构稳定、损伤修复等功能，其性质和数量影响着皮肤屏障的稳固及部分皮肤病的发生。目前已经有较为系统的皮肤角质层取样法、液相色谱法、电离喷雾质谱法、大气压化学电离质谱法、串联质谱法等分析法。生物化学法：生物化学法是借助光谱分析、电子显微镜以及其他物理、化学技术手段，对影响功效的特征指标(如自由基)、重要生物分子(如蛋白质等)含量进行测试分析的一种方法。在抗炎抗敏的功效评价中常用的生物化学实验有透明质酸酶抑制实验及自由基清除实验等，也有部分研究人员使用红细胞溶血试验。细胞生物学法：细胞生物学法通过建立细胞模型，在体外模拟人体生理环境来培养细胞，测量细胞接触受试物前后的变化来验证原料的功效性。皮肤角质粘贴试验通过收集脱落的角质细胞标本，来了解皮肤屏障重要结构——角化套膜的形态和功能。试验有多种测试方法，常用胶带粘贴皮肤收集皮肤鳞屑，通过对cE进行荧光染色判断其成熟度来评估皮肤屏障的受损程度。三维重组皮肤模型：在利用皮肤模型评价化妆品的舒缓修复功效时，可将其作用于经表面活性剂或微生物等刺激后的表皮或全皮模型上，通过检测化妆品对刺激后皮肤模型对照组织活力的影响、炎性介质(PGE2)和炎症因子(如IL一1a、IL一8和TNF—a等)的分泌情况以及相关基因的表达情况来评估化妆品功效原料或配方的抗炎修复能力。动物实验法：动物实验法是目前应用最为广泛的抗炎功效评价方法，目前已有使用动物作为受试对象，在进行斑贴激发后，由实验者根据动物皮肤受损情况打分评价样品的抗炎效果。主观评价法：主观评价包括视觉评估和受试者自我评估。视觉评估通常由专家或医生对受试者的皮肤状态如皮肤颜色、皮肤弹性等指标进行定性或分级评测；受试者自我评估多采用问卷调查形式进行，指标包括瘙痒感、刺痛感、烧灼感及紧绷感等，受试者根据问卷对自身皮肤敏感程度进行评分。半主观评价法：常见的有乳酸刺痛试验和辣椒素试验等。乳酸刺痛试验：在室温下，将5％或10％的乳酸水溶液50μL涂抹于鼻唇沟及任意一侧面颊，分别在0，2.5，5和8min时询问受试者的自觉症状，按4分法进行评分。然后将两次分数相加，总分≥3分者为乳酸刺痛反应阳性。辣椒素试验：将直径为0.8cm的两层滤纸放置于一侧鼻唇沟外约1cm处及任意一侧面颊，将含量为0.1％的辣椒素50μL置于滤纸上，询问受试者的感觉。如果受试者的灼痛感觉持续时间>30s，且程度≥3分者为阳性。客观评价法：客观评价法是通过仪器对受试者使用化妆品前后的皮肤状态参数(皮肤的水分散失量、皮肤水分含量、皮肤红斑指数、皮肤表面酸碱度和皮肤油脂分泌量)进行采集、样本分析和统计分析，进而对化妆品进行功效评价的一种方法。上述评价方法中的评价指标如数量、身体情况、剂量、面积、部位、感觉、毒性效应等级、组织火力等的确定依赖于实施者的经验和主观判断，导致试验评分主观性强，对结果有较大的主观干扰因素。同时动物实验法不符合3R(减少、替代、优化)原则，不符合动物保护和福利的要求。三维重组实验模型中被认可的3D皮肤模型大多为国外生产的，价格昂贵，其培养和运输成本过高。物理化学法只能检测已知其活性成分的物质，对于未知其活性成分的物质或其结构和成分较复杂的物质，不能使用该方法评价其舒缓效果。再者生物化学法和细胞生物学法不能模仿体内，无法预测其作用靶点和作用，多用于活性成分的初筛和高通量筛选。
技术实现思路
针对现有评价方法的评价指标选取、处理的主观性较强，对评价结果带来主观因素干扰的问题，本专利技术的目的在于提供一种评价化妆品对皮肤炎症舒缓或修复功效的方法，以实现评价过程排除主观干扰因素，评价结果更加客观。本专利技术提供如下的技术方案：一种评价化妆品对皮肤炎症舒缓或修复功效的方法，包括以下步骤：(1)设置正常对照组：以斑马鱼为受试对象，置于水中培养；(2)设置模型对照组：以斑马鱼为受试对象，置于水中培养，并在培养开始时以水溶方式向水中加入皮肤炎症诱导剂；(3)设置测试组：以斑马鱼为受试对象，置于水中培养，并在培养开始时以水溶方式向水中加入待测化妆品和皮肤炎症诱导剂；(4)检测：培养相同的时间后，取正常对照组、模型对照组、测试组的斑马鱼，置于荧光显微镜下拍照并保存图片，采用图像处理软件基于统计学方法统计斑马鱼的皮肤炎症部位的中性粒细胞个数；(5)炎症舒缓或修复作用评价：按照下述公式计算待测化妆品对皮肤炎症舒缓或修复作用：其中，N(测试组)表示测试组的斑马鱼的皮肤炎症部位中性粒细胞个数的统计值；N(模型对照组)表示模型对照组中斑马鱼皮肤炎症部位中性粒细胞个数的统计值。本专利技术的评价方法以斑马鱼为受试对象，通过设置斑马鱼皮肤炎症模型判断化妆品的功效，化妆品可与皮肤炎症诱导剂同时加入，或者化妆品加入后尽快立即加入皮肤炎症诱导剂，或者先加入皮肤炎症诱导剂，然后加入化妆品。其中斑马鱼与人体的基因同源性达到87％，信号传导通路与人类基本近似。专利技术人研究发现，中性粒细胞是体内数量最多的白细胞，在斑马鱼体内发挥固有免疫作用。当斑马鱼皮肤因皮肤炎症诱导剂引发皮肤炎症时，会发生血管舒张、毛细血管网的通透性增强、炎性介导释放等一系列类人的体内行为，这些炎症征状诱导斑马鱼体内的中性粒细胞发生免疫应答，向皮肤表皮迁移并聚集。斑马鱼皮肤的炎症程度越高，斑马鱼体皮肤表皮的炎症部位聚集的中性粒细胞就越多。而在化妆品存在的情况下，若化妆品具有炎症舒缓或修复作用，将使斑马鱼皮肤的炎症程度得到缓和，此时斑马鱼皮肤炎症部位的中性粒细胞将相对减少。这样通过图像分析软件统计并采用方差分析和Dunnett’sT-检验，分析在化妆品存在与否情况下的炎症部位的中性粒细胞的个数来确定化妆品对皮肤炎症的舒缓或修复功效，评价指标和评价过程与现有技术相比，排除了主观因素和主观指标，评价结果将更加客观。而且斑马鱼的饲养成本低，体积小，发育周期短、单次产卵次数高的特点能同时进行多个供试品的评价。并且本申请的技术方案不仅能够评价成分已知的化妆品的舒缓或修复功效，对于宣称具有舒缓或修复功效而组分未知的化妆品，也可以进行评价。作为本专利技术方法的优选，步骤(5)中，当炎症舒缓或修复作用≥30％或者显著性水平p<0.05时，判断为待测化妆品对炎症有舒缓或修复作用，否则判断为对炎症无舒缓或修复作用或作用不明显。通过设置双判断标准，提高评价结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种评价化妆品对皮肤炎症舒缓或修复功效的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)设置正常对照组：以斑马鱼为受试对象，置于水中培养；/n(2)设置模型对照组：以斑马鱼为受试对象，置于水中培养，并在培养开始时以水溶方式向水中加入皮肤炎症诱导剂；/n(3)设置测试组：以斑马鱼为受试对象，置于水中培养，并在培养开始时以水溶方式向水中加入待测化妆品和皮肤炎症诱导剂；/n(4)检测：培养相同的时间后，取正常对照组、模型对照组、测试组的斑马鱼，置于荧光显微镜下拍照并保存图片，采用图像处理软件基于统计学方法统计斑马鱼的皮肤炎症部位的中性粒细胞个数；/n(5)炎症舒缓或修复作用：按照下述公式计算待测化妆品对皮肤炎症舒缓或修复作用：/n

【技术特征摘要】
1.一种评价化妆品对皮肤炎症舒缓或修复功效的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设置正常对照组：以斑马鱼为受试对象，置于水中培养；
(2)设置模型对照组：以斑马鱼为受试对象，置于水中培养，并在培养开始时以水溶方式向水中加入皮肤炎症诱导剂；
(3)设置测试组：以斑马鱼为受试对象，置于水中培养，并在培养开始时以水溶方式向水中加入待测化妆品和皮肤炎症诱导剂；
(4)检测：培养相同的时间后，取正常对照组、模型对照组、测试组的斑马鱼，置于荧光显微镜下拍照并保存图片，采用图像处理软件基于统计学方法统计斑马鱼的皮肤炎症部位的中性粒细胞个数；
(5)炎症舒缓或修复作用：按照下述公式计算待测化妆品对皮肤炎症舒缓或修复作用：



其中，N(测试组)表示测试组的斑马鱼皮肤炎症部位中性粒细胞个数的统计值；N(模型对照组)表示模型对照组中斑马鱼皮肤炎症部位中性粒细胞个数的统计值。


2.根据权利要求1所述的评价化妆品对皮肤炎症舒缓或修复功效的方法，其特征在于，步骤(5)中，当炎症舒缓或修复作用≥30％或者显著性水平p＜0.05时，判断为待测化妆品对炎症有舒缓或修复作用，否则判断为对炎症无舒缓或修复作用或作用不明显。


3.根据权利要求1所述的评价化妆品对皮肤炎症舒缓或修复功效的方法，其特征在于，所用斑马鱼为受精后2天转基因中性粒...

【专利技术属性】
技术研发人员：周佳丽，郭盟，朱晓宇，徐懿乔，郭胜亚，张勇，曹兵兵，李春启，
申请(专利权)人：南京新环检测科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32