一种鉴定SLC12A3基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定SLC12A3基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法。所述试剂盒中含有如下引物对：F1:CCACAACAGAGACGCCTGGGGAGG；R1：CGTCCCCACTAAATAGTTGGCAAACG；F2：CCACAACAGAGACGCCTGGGGTCC；R2：CGTCCCCACTAAATAGTTGGCAATGA；所述两个突变位点为C.37G>C、C.887C>T突变位点。本发明专利技术能够鉴定C.37G>C、C.887C>T突变位点是在同一条染色体，还是不同的染色体上，工作量小，耗时短，易操作。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定SLC12A3基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法
本专利技术属于生物医学检测
，具体涉及一种鉴定PAH基因同时含两个突变位点(C.37G>C、C.887C>T)位置的试剂盒及方法。
技术介绍
编码噻嗪类利尿剂敏感的钠氯协同转运体(NCC)的SLC12A3基因发生致病突变可导致Gitelman综合征，是一种由肾脏远曲小管钠氯协同转运蛋白功能障碍所致的常染色体隐性遗传病，主要临床特点为肾性失钾导致的低钾血症、代谢性碱中毒，常伴有低血镁、低尿钙和肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)活化，血压正常或偏低。正常情况下，通道蛋白NCC参与肾小球滤过液中5％-10％氯离子和钠离子的重吸收，当基因突变导致NCC结构和(或)功能障碍时，氯离子和钠离子从远端肾小管重吸收减少，肾脏重吸收水减少，继发RAAS活化、肾性失钾和钙重吸收减少。基因检测是诊断Gitelman综合征的金标准，检测到SLC12A3纯合突变或复合杂合突变可确诊，单杂合突变的患者需结合临床，新发现的突变需要体外功能试验确定突变的致病性。不同的SLC12A3基因的突变对SLC12A3活性及结构影响的程度不同。针对于本案中涉及到的两个突变位点，发生在同一条或者不同的染色体上，对患者病情严重程度的影响是不同的。如果两个突变发生在同一条染色体上，则不致病；两个突变分别发生在不同的染色体上，则致病。为了评估疾病的严重程度，鉴定已知的不同的SLC12A3基因突变分布在同一条还是不同染色体上，对疾病的诊断具有决定性作用。现有的方法是提取DNA，构建载体，进行体外表达实验，需要全套的分子生物学及微生物、细胞培养的实验室，难度极大，且工作量大，耗时长，普通实验室难以实施。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术的不足，提供一种鉴定SLC12A3基因同时含两个突变位点位置的试剂盒及方法。为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为：鉴定SLC12A3基因同时含两个突变位点位置的试剂盒中含有如下引物对：F1：CCACAACAGAGACGCCTGGGGAGG(SEQIDNO.1)R1：CGTCCCCACTAAATAGTTGGCAAACG(SEQIDNO.2)F2：CCACAACAGAGACGCCTGGGGTCC(SEQIDNO.3)R2：CGTCCCCACTAAATAGTTGGCAATGA(SEQIDNO.4)；所述两个突变位点为：C.37G>C、C.887C>T突变位点。优选地，引物对按如下排列组合使用：①：F1+R1②：F1+R2③：F2+R1④：F2+R2。优选地，根据C.37G>C、C.887C>T突变分布情况，引物对按如下排列组合使用：①：当待测样本同时含C.37G>C、C.887C>T突变但分布在不同染色体上时：F1+R2或F2+R1；其中，F1和R1是检测野生型的引物；②当待测样本同时含C.37G>C、C.887C>T突变且分布在同一条染色体上时：F2+R2。基于上述试剂盒鉴定同时含C.37G>C、C.887C>T突变位点的方法是采用所述试剂盒中的引物对，在如下次序和条件下进行扩增检测：①：94℃，5min；②：94℃，30s；60℃，30s；72℃，2min；35Cycles；③：72℃，13min；25℃，∝；若扩增后的片段经琼脂糖凝胶电泳出现特异性条带，则表明存在C.37G>C、C.887C>T。本专利技术根据SLC12A3基因已知位点C.37G>C、C.887C>T突变，设计两组引物，第一组：3′端碱基与正常的模板碱基互补，第二组：3′端碱基与突变的模板碱基互补。基于耐热TaqDNA聚合酶缺乏3′→5′外切校正活性的特点，引物3′端的特异碱基分别互补于野生型和突变型等位基因的相对碱基，若此碱基对形成错配，链延伸反应就会因3′，5′-磷酸二酯键形成障碍而受阻，所以其扩增结果为：野生模板阻碍，突变引物放大；或突变模板阻碍，野生引物放大。本专利技术设计了不同的引物对，将提取的模板扩增后进行琼脂糖凝胶电泳从而达到鉴定的目的。本专利技术能够鉴定C.37G>C、C.887C>T突变位点是在同一条染色体，还是不同的染色体上。现有的方法是提取DNA、构建克隆载体、构建克隆载体、体外表达实验，需要全套的分子生物学及微生物、细胞培养的实验室，难度极大，且工作量大，耗时2-3个月，普通实验室难以实施，本专利技术仅需要引物设计、提取DNA、扩增与跑胶，能够在1天内完成所有试验，工作量小，耗时短，易操作成本极低，且普通分子实验室均可操作。附图说明图1为Z、T、S样本电泳图；图2为对比引物对电泳图。具体实施方式1.DNA提取选取3个样本，一个野生型，命名为Z，一个同时含C.37G>C、C.887C>T突变但分布在不同染色体上的样本，命名为T，另一个同时含C.37G>C、C.887C>T突变且分布在同一条染色体上的样本，命名为S。根据试剂QIAampDNABloodMiniKit(250)(凯杰，163030523)说明书提取DNA，保存于-20℃备用。2.PCR扩增根据表1所示反应体系进行片段扩增(商用试剂购自南京诺唯赞生物科技有限公司)。表1反应体系试剂体积(μL)2×VazymeLAmpMasterMix(商用)25ddH2O13PrimersMixer(F+R)8模板DNA(商用)4总体积50按照表1配置反应体系，其中，PrimersMixer(F+R)为扩增引物。本专利技术设计了两组扩增引物序列，如下表2。其中F1、F2序列3’端是针对位点C.37G>C野生型和突变型模板，R1、R2序列3’端是针对位点C.887C>T野生型和突变型模板。表2引物序列按5P浓度1:1F端与R端自由组合，可得4组PrimersMixer(F+R)混合物，如表3。表2引物序列表3PrimersMixer(F+R)引物组合第1组F1+R1第2组F1+R2第3组F2+R1第4组F2+R2所有试剂配制完成后，将每组引物分装成3份，分别加入样本Z、T和S，得12份混合液，按照引物分组命名为Z1-Z4，T1-T4和S1-S4，并按照下列扩增程序进行PCR扩增：[94℃，5min]；[94℃，30s；60℃，30s；72℃，2m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴定SLC12A3基因同时含两个突变位点位置的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如下引物对：/nF1：CCACAACAGAGACGCCTGGGGAGG/nR1：CGTCCCCACTAAATAGTTGGCAAACG/nF2：CCACAACAGAGACGCCTGGGGTCC/nR2：CGTCCCCACTAAATAGTTGGCAATGA；/n所述两个突变位点为：C.37G>C、C.887C>T突变位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种鉴定SLC12A3基因同时含两个突变位点位置的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如下引物对：
F1：CCACAACAGAGACGCCTGGGGAGG
R1：CGTCCCCACTAAATAGTTGGCAAACG
F2：CCACAACAGAGACGCCTGGGGTCC
R2：CGTCCCCACTAAATAGTTGGCAATGA；
所述两个突变位点为：C.37G>C、C.887C>T突变位点。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，引物对按如下排列组合使用：
①：F1+R1
②：F1+R2
③：F2+R1
④：F2+R2。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，根据C.37G>C、C.887C>...

【专利技术属性】
技术研发人员：李淼，余艳，龚强，周梅华，汪静，
申请(专利权)人：长沙金域医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43