细胞培养板，其制备方法和检测物质的方法技术

本公开涉及一种细胞培养板及其制备方法，该胞培养板包括一个或多个细胞培养孔，所述细胞培养孔包括用于将孔分隔成至少两个隔室的至少一个阻隔件，其中所述阻隔件包含纳米原纤纤维素水凝胶。本公开还涉及一种检测物质的方法。

【技术实现步骤摘要】
细胞培养板，其制备方法和检测物质的方法
本申请涉及一种细胞培养板及其制备方法，该细胞培养板包括将板上的细胞培养孔分隔成至少两个隔室的纳米原纤纤维素阻隔件。本申请还涉及一种检测物质的方法以及一种评估物质对细胞的作用的方法。专利技术背景在某些细胞培养方法中，可能有必要将细胞培养区域(例如培养皿或多孔板中的孔)分隔成两个或更多个隔室。可以设置阻隔件以将区域分隔成隔室。可能希望某些试剂可以穿透阻隔件，但是例如细胞不能穿透。多孔塑料插件可以用作阻隔件。然而，这种插件可能与活细胞不完全相容，而且试剂通过孔的扩散可能不是最佳的。期望获得这样的阻隔件材料，其非常适合于活物质，提供期望的扩散性质并且易于处理。
技术实现思路
在本专利技术中，发现纳米原纤纤维素是在细胞培养应用中提供阻隔性能的理想材料。纳米原纤纤维素可阻止细胞通过阻隔件，但允许较小的分子甚至细胞外囊泡通过。也可以通过调节其浓度和化学形式来控制纳米原纤纤维素的阻隔性能。本申请提供了一种细胞培养板，其包括一个或多个细胞培养孔，所述细胞培养孔包括用于将孔分隔成至少两个隔室的至少一个阻隔件，其中所述阻隔件包含纳米原纤纤维素水凝胶。本申请还提供了一种制备细胞培养板的方法，该方法包括：-提供包括一个或多个细胞培养孔的细胞培养板，-提供一种包含纳米原纤纤维素，优选包含0.8-2.5％(w/w)纳米原纤纤维素的水性分散体，-在至少一个细胞培养孔中由纳米原纤纤维素形成至少一个阻隔件，以将该孔分隔为至少两个隔室。所获得的细胞培养板可以是本文所述的任何细胞培养板。本申请还提供了一种用于检测物质的方法，该方法包括：-提供在第一隔室中包含第一细胞的细胞培养板，和-从另一隔室中检测至少一种物质。主要实施方式在独立权利要求中限定。在从属权利要求中公开了各种实施方式。除非另有明确说明，否则权利要求书和说明书中记载的实施方式和实施例可以相互自由组合。以水凝胶形式存在的纳米原纤纤维素提供了一种无毒、生物相容且也可生物降解的亲水性基质。基质可以酶促降解，例如通过添加纤维素酶来降解。另一方面，水凝胶在生理条件下是稳定的，不需要通过使用其他试剂进行交联。可以通过调节纳米原纤纤维素的化学和/或物理性质来控制纳米原纤纤维素水凝胶的性质，例如渗透性。包含纳米原纤纤维素的水凝胶的某些有利性质包括柔韧性，弹性和可重塑性。由于水凝胶包含大量水，因此对分子也显示出良好的渗透性。实施方方式的水凝胶还提供高的保水能力和分子扩散性质速度。本文所述的纳米原纤纤维素水凝胶可用于医学和科学应用，其中包含纳米原纤纤维素的材料与生物接触。如本文所述的包含纳米原纤纤维素的产品与生物具有高度生物相容性，并提供多种有益效果。不囿于任意具体理论的束缚，认为含有极其亲水的纳米原纤纤维素的水凝胶具有非常高的比表面积，并因此具有高保水能力，当施用于细胞时，在细胞和包含纳米原纤纤维素的水凝胶之间形成有利的潮湿环境。纳米原纤纤维素中的大量游离羟基在纳米原纤纤维素和水分子之间形成氢键，并且能够形成凝胶和产生纳米原纤纤维素的高保水能力。纳米原纤纤维素水凝胶包含大量的水，并且还能够使流体和/或试剂迁移。纳米原纤纤维素可用作细胞基质，因此提供一种保护细胞并帮助它们维持其活力的环境。纳米原纤纤维素材料的一个优点是，纤维素纳米纤维的原纤网络的尺寸非常接近胶原纳米纤维的天然ECM网络。此外，纤维素纳米纤维是非动物性材料，因此没有疾病传播的风险。使用本专利技术的材料，可以获得用于细胞的透明且多孔的基质，并且与替代方案相比，该材料的处理容易。纤维素纳米纤维的荧光背景可以忽略不计。纤维素纳米纤维水凝胶具有最佳的弹性、刚度、剪切应力、机械附着性和孔隙率，也可用作3D和2D细胞储存或培养基质。由于纳米原纤纤维素水凝胶阻隔件可以阻止细胞通过该阻隔件，但允许较小的物质迁移，因此可以用于研究细胞的多种方法中。可以使得一种或多种细胞类型在它们自己的隔室中分离，并且可以在同一隔室或在阻隔件后面的另一隔室中研究一种或多种由细胞分泌的试剂和/或另外提供到隔室中的试剂。这样，可以消除与细胞的直接接触。例如，可以研究试剂(例如第一细胞分泌的代谢物)或该试剂提供的对第二细胞的作用。当细胞在不同的隔室中时，它们在物理上彼此隔离，可以消除细胞直接相互作用即物理接触的影响。因此，有可能获得可用于医学和科学研究的产品。纳米原纤纤维素是不同于常规纤维素的特定纳米级材料，因此可以制备表现出与常规产品不同性能的材料和产品。可以使用能够将水凝胶材料输出为所需形式的装置，例如利用增材制造的装置(即3D打印)，来制备此类产品。附图简要说明图1显示了48孔板中的直壁形阻隔件。图2显示了6孔板中的圆形阻隔件。上层阻隔件由1.5％GrowDex(批号11878)构成，下层阻隔件由0.65％GrowDex(批号11898)构成。颜色来自细胞培养基。图3显示了在用GrowDex阻隔件分隔的孔中0.2％台盼蓝(TrypanBlue)的分布。图4显示了针对孔A1和B1构建的1.5％GrowDex阻隔件，针对孔A3和B3构建的0.65％GrowDex阻隔件。图5显示了向1.5％GrowDex阻隔件迁移的NR8383细胞的100倍放大图。红色箭头指向阻隔件。黑色箭头指向施加细胞之处的阻隔件的内侧(无GrowDex)。图6显示了400倍的放大率。左图：向1.5％GrowDex阻隔件迁移的NR8383细胞。右图：在GrowDex阻隔件中的NR8383细胞。图7显示了NR8383细胞向0.65％GrowDex阻隔件迁移。黑色箭头指向施加细胞之处的阻隔件的内侧(细胞未附着于GrowDex)。红色箭头指向阻隔件。图8显示了100倍的放大率。左图：移液至0.65％GrowDex阻隔件内侧的NR8383细胞(细胞未附着于GrowDex)。右图：在0.65％GrowDex阻隔件中的NR8383细胞。图9显示了在0.65％GrowDex阻隔件外侧的NR8383细胞的100倍放大图(蓝色箭头)。红色箭头指向阻隔件。图10显示司来吉兰和扑热息痛对人BJ成纤维细胞活力的影响。图11显示了被纳米原纤纤维素阻隔件分隔为两个大小相等的隔室的孔的示意图。图12显示了使用明亮的GrowDex制备的阻隔件。右列中的三个“粉红色”阻隔件：2.0％GrowDex。左侧的两个“粉红色”阻隔件：～1.7–1.9％GrowDex。没有粉红色培养基的两个孔(左上)：～1.5％GrowDex。图13显示了在阻隔件左侧拍摄的HepaRG细胞(左图)和在阻隔件右侧拍摄的BJ成纤维细胞(右图)。图14显示了通过GrowDex阻隔件分隔为两个隔室的(24孔板)孔的多点吸光度测量。HepaRG细胞位于阻隔件的左侧，BJ成纤维细胞位于阻隔件的右侧。图15显示了在24孔板中新鲜制备的GrowDex阻隔件。图16显示了在24孔板中新鲜制备的GrowDex阻隔本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞培养板，其包括一个或多个细胞培养孔，所述细胞培养孔包括用于将孔分隔成至少两个隔室的至少一个阻隔件，其中所述阻隔件包含纳米原纤纤维素水凝胶，例如其中所述阻隔件的壁厚在0.5–2mm的范围内。/n

【技术特征摘要】
20190610 EP 19397521.61.一种细胞培养板，其包括一个或多个细胞培养孔，所述细胞培养孔包括用于将孔分隔成至少两个隔室的至少一个阻隔件，其中所述阻隔件包含纳米原纤纤维素水凝胶，例如其中所述阻隔件的壁厚在0.5–2mm的范围内。


2.如权利要求1所述的细胞培养板，其中，所述纳米原纤纤维素水凝胶包含0.8–2.5％(w/w)的纳米原纤纤维素，优选1.0–2.1％(w/w)。


3.如权利要求1或2所述的细胞培养板，其包含位于细胞培养板和纳米原纤纤维素水凝胶之间的粘合剂，例如基于胶原的粘合剂，基于纤维蛋白原的粘合剂，基于明胶的粘合剂或基于赖氨酸的粘合剂，例如聚-D-赖氨酸或明胶。


4.如前述权利要求中任一项所述的细胞培养板，其中，所述至少一个阻隔件包围所述细胞培养孔上的至少一个区域，例如，所述阻隔件为圆形的形式。


5.如前述权利要求中任一项所述的细胞培养板，其中，所述纳米原纤纤维素当分散在水中时提供在1000–100000Pa·s范围内、例如在5000-50000Pa·s范围内的零剪切粘度，和在1–50Pa范围内、例如在3–15Pa范围内的屈服应力，这些数值是通过使用旋转流变仪在22℃±1℃下，稠度为0.5重量％(w/w)的条件下在水性介质中确定的，以及/或者其中所述纳米原纤纤维素的平均原纤直径为200nm或更小，例如在1–200nm的范围内。


6.如前述权利要求中任一项所述的细胞培养板，其中，所述纳米原纤纤维素选自未改性的纳米原纤纤维素，阴离子改性的纳米原纤纤维素和氧化的纳米原纤纤维素，例如TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。


7.如前述权利要求中任一项所述的细胞培养板，其中，至少一个隔室包含与阻隔件相比具有更低浓度的凝胶，例如与阻隔件相比具有更低浓度的纳米原纤纤维素的纳米原纤纤维素水凝胶，例如0.7％(w/w)或更低的浓度，例如0.2-0.7％(w/w)的浓度。


8.如前述权利要求中任一项所述的细胞培养板，其中，孔在一个隔室中包含一种类型的细胞，并且任选地在至少一个其他隔室中包含相同种类和/或其他类型的细胞，例如选自以下的细胞：肝细胞，例如肝实质细胞，例如肝细胞癌细胞，内皮细胞，脂肪细胞，心肌细胞，肾细胞，免疫细胞，例如巨噬细胞和单核...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·诺珀宁，L·帕索嫩，M·马讷斯托姆，T·海诺宁，T·托莫拉，
申请(专利权)人：芬欧汇川集团，
类型：发明
国别省市：芬兰;FI