一种用WSL细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的应用及其制备方法技术

本发明专利技术属于兽用疫苗的技术领域，本发明专利技术提供了一种用WSL细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的应用及其制备方法。本发明专利技术提供的用WSL细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的方法，包括如下步骤：(1)WSL细胞系的复苏和培养：取出冻存的WSL细胞系培养至细胞形成单层；(2)制备毒种：取所述WSL细胞系加入含非洲猪瘟病毒的细胞维持液进行毒种培养，制得毒种；(3)制备病毒液：取所述WSL细胞系加入含毒种的细胞维持液进行病毒液培养，制得病毒液；(4)配制疫苗：在所述病毒液中加入疫苗保护剂和抗生素，进行冷冻真空干燥，即得成品。本发明专利技术生产的非洲猪瘟病毒活疫苗安全性高、免疫保护好，对非洲猪瘟强毒攻击具有完全的免疫保护作用。

【技术实现步骤摘要】
一种用WSL细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的应用及其制备方法
本专利技术涉及兽用疫苗的
，尤其涉及一种用WSL细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的应用及其制备方法。
技术介绍
目前国内、国外非洲猪瘟病毒及其基因缺失病毒的体外增值培养以及基因缺失活疫苗的制备所用的细胞基本是原代猪肺泡巨噬细胞和猪骨髓细胞，原代猪肺泡巨噬细胞和猪骨髓细胞制备过程繁琐，操作特别麻烦，易造成细菌和外源病毒污染，特别是骨髓细胞在接毒前还需要多次加入刺激因子和换液，此方法成本高、操作繁琐、劳动强度大、易于污染、且批间差异大、不利于规模化大生产。也有报道用Vero细胞培养非洲猪瘟病毒，但病毒适应性差，不稳定，毒价低。因此，有必要提供一种具有操作简单、不易染菌、工艺稳定、易于生产、病毒含量高、质量易控等优点，可显著提高疫苗产量和质量的非洲猪瘟病毒疫苗。
技术实现思路
为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种用WSL细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的应用。优选的，所述非洲猪瘟病毒为非洲猪瘟病毒基因缺失毒株SY18ΔMGF/CD2v。本专利技术还提供了一种用WSL细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的方法，包括如下步骤：(1)WSL细胞系的复苏和培养：取出冻存的WSL细胞系培养至细胞形成单层；(2)制备毒种：取所述WSL细胞系加入含非洲猪瘟病毒的细胞维持液进行毒种培养，制得毒种；(3)制备病毒液：取所述WSL细胞系加入含毒种的细胞维持液进行病毒液培养，制得病毒液；(4)配制疫苗：在所述病毒液中加入疫苗保护剂和抗生素，进行冷冻真空干燥，即得成品非洲猪瘟病毒活疫苗。优选的，所述含非洲猪瘟病毒的细胞维持液中非洲猪瘟病毒的体积百分比浓度为3％～5％，所述含非洲猪瘟病毒的细胞维持液的添加量为培养瓶体积的8～12％，每毫升所述毒种中病毒含量在107.0TCID50以上。优选的，所述含毒种的细胞维持液中毒种的体积百分比浓度为3％～5％，所述含毒种的细胞维持液的添加量为培养瓶体积的8～12％，每毫升所述病毒液中病毒含量在106.5TCID50以上。优选的，所述毒种培养和病毒液培养的条件独立的为：在36℃～37℃的温度下培养48～72h。优选的，所述疫苗保护剂是按照明胶：蔗糖：水＝8～10g：40～45g：100mL的比例混合溶解灭菌制得，病毒液与疫苗保护剂混配的体积比为5～9:1，所述抗生素包括青霉素和/或链霉素，所述青霉素的添加量为100IU/mL，所述链霉素的添加量为100ug/mL。优选的，所述非洲猪瘟病毒活疫苗每头份病毒含量不低于104.5TCID50。本专利技术还提供了一种用WSL细胞系制备的非洲猪瘟病毒活疫苗。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)用细胞系替代原代猪肺泡巨噬细胞、猪骨髓细胞生产非洲猪瘟病毒活疫苗，细胞制备简单容易，细胞来源和制备过程中不易污染细菌、霉菌和支原体，可从源头控制外源污染的问题，保证生产出来疫苗的纯净性和安全性。(2)采用细胞系培养的病毒液，产毒稳定、批间差异小、质量可控，制备出的疫苗效价均一稳定，确保疫苗的免疫效力，经免疫攻毒试验结果显示，可达到100％保护。(3)用细胞系生产非洲猪瘟病毒活疫苗，具有生产工艺简单、易操作、产量大、成本低等特点，可以大规模生产，具有良好的经济效益和应用前景。具体实施方式本专利技术制备的非洲猪瘟病毒基因缺失毒株SY18ΔMGF/CD2v活疫苗安全性高、免疫保护好，对非洲猪瘟强毒攻击具有完全的免疫保护作用。本专利技术提供一种用WSL细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的应用。在本专利技术中，所述非洲猪瘟病毒优选为非洲猪瘟病毒基因缺失毒株SY18ΔMGF/CD2v，来源于中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所。本专利技术还提供了一种用WSL细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的方法，包括如下步骤：(1)WSL细胞系的复苏和培养：取出冻存的WSL细胞系培养至细胞形成单层；(2)制备毒种：取所述WSL细胞系加入含非洲猪瘟病毒的细胞维持液进行毒种培养，制得毒种；(3)制备病毒液：取所述WSL细胞系加入含毒种的细胞维持液进行病毒液培养，制得病毒液；(4)配制疫苗：在所述病毒液中加入疫苗保护剂和抗生素，进行冷冻真空干燥，即得成品非洲猪瘟病毒活疫苗。在本专利技术中，所述WSL细胞系为猪肺泡巨噬细胞，所述WSL细胞系购买自上海莼试生物技术有限公司。WSL细胞系的复苏步骤为：从液氮中取出冻存的WSL细胞，迅速放入37℃的水浴中融化，得到细胞悬液，然后用细胞生长液将细胞悬液浓度优选稀释到40～60万个/mL，进一步优选为50万个/mL，然后分装于细胞培养瓶中，每瓶装量为培养瓶容积量的1/10，塞紧瓶口，置于温室中培养，待细胞单层形成后即可进行传代培养。在本专利技术中，所述细胞生长液的配方优选为：含8～10％胎牛血清的RPMI-1640细胞培养液，再按照100IU/mL加入青霉素、100ug/mL加入链霉素，pH值优选为7.0～7.2，进一步优选为7.1。在本专利技术中，所述细胞培养瓶的规格优选为1000mL培养瓶。在本专利技术中，所述置于温室中培养的温度优选为36℃～37℃，时间优选为48～72h，进一步优选为72h。WSL细胞系的培养：将上述长成单层的细胞经胰酶消化后，按照1:3的分种率分散到1000mL的细胞培养瓶中，在分种后的细胞培养瓶中加入100mL细胞生长液继续培养，形成单层细胞后即可用于接种病毒。制备毒种：取所述WSL细胞系加入含非洲猪瘟病毒的细胞维持液进行毒种培养，制得毒种；在本专利技术中，优选取上述形成单层细胞的WSL细胞系培养瓶，弃去培养瓶中的细胞生长液后，加入含非洲猪瘟病毒的细胞维持液进行毒种培养。在本专利技术中，所述含非洲猪瘟病毒的细胞维持液中非洲猪瘟病毒的体积百分比浓度优选为3％～5％，进一步优选为3.5％；所述含非洲猪瘟病毒的细胞维持液的添加量优选为培养瓶体积的8～12％，进一步优选为10％。在本专利技术中，所述细胞维持液的配方优选为：含3～5％胎牛血清的RPMI-1640细胞培养液，再加入青霉素100IU/ml、链霉素100ug/ml，pH值优选为7.2～7.4，进一步优选为7.3。在本专利技术中，所述毒种培养的温度优选为36℃～37℃，所述毒种培养的时间优选为3天，即当病变细胞(CPE)达到75％以上时即可收获培养液作为毒种。在本专利技术中，每毫升所述毒种中病毒含量优选在107.0TCID50以上。取形成单层细胞的WSL细胞系培养瓶，弃去培养瓶中的细胞生长液后，加入含毒种的细胞维持液进行病毒液培养，制得病毒液；在本专利技术中，含毒种的细胞维持液优选是在细胞维持液中加入毒种混合得到，所述含毒种的细胞维持液中毒种的体积百分比浓度优选为3～5％，进一步优选为3.5％。在本专利技术中，所述含毒种的细胞维持液的添加量优选为培养瓶体积的8～12％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用WSL细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的应用。/n

【技术特征摘要】
1.一种用WSL细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的应用。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒为非洲猪瘟病毒基因缺失毒株SY18ΔMGF/CD2v。


3.一种用WSL细胞系制备非洲猪瘟病毒活疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)WSL细胞系的复苏和培养：取出冻存的WSL细胞系培养至细胞形成单层；
(2)制备毒种：取所述WSL细胞系加入含非洲猪瘟病毒的细胞维持液进行毒种培养，制得毒种；
(3)制备病毒液：取所述WSL细胞系加入含毒种的细胞维持液进行病毒液培养，制得病毒液；
(4)配制疫苗：在所述病毒液中加入疫苗保护剂和抗生素，进行冷冻真空干燥，即得成品非洲猪瘟病毒活疫苗。


4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述含非洲猪瘟病毒的细胞维持液中非洲猪瘟病毒的体积百分比浓度为3％～5％，所述含非洲猪瘟病毒的细胞维持液的添加量为培养瓶体积的8～12％，每毫升所述毒种中病毒含量在107.0TCID50以上。
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【专利技术属性】
技术研发人员：张中洋，吴金，郭志文，高玉龙，宝梅英，杨金梅，吴文霞，汪春雨，
申请(专利权)人：吉林和元生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22